抗微生物肽CRAMP及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及抗微生物肽CRAMP及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将首尾环化，获得环肽CRAMP，经研究发现抗微生物肽CRAMP及其环肽对铜绿假单胞菌成熟生物膜有明显的清除作用，本研究对成熟的铜绿假单胞菌生物膜的消除策略及其机制的深入研究有着十分重要的科学意义和医学临床价值。

Application of antimicrobial peptide CRAMP and its cyclic peptides in preparation of drugs for removing bacterial biofilms

The present invention relates to the application of antimicrobial peptide CRAMP and its cyclic peptide in the preparation of antimicrobial biofilm-scavenging drugs. The amino acid sequence of antimicrobial peptide CRAMP is shown in SEQ ID NO.1, and the head and tail are cyclized to obtain cyclic peptide CRAMP. It is found that the antimicrobial peptide CRAMP and its cyclic peptide have obvious effects on the mature biofilm of Pseudomonas aeruginosa. This study is of great scientific significance and clinical value for the further study of elimination strategies and mechanisms of mature Pseudomonas aeruginosa biofilms.

【技术实现步骤摘要】
抗微生物肽CRAMP及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及抗微生物肽CRAMP和环肽，以及抗微生物肽CRAMP和环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用。
技术介绍
细菌生物膜(biofilm，BF)是多个细菌黏附于非生物或生物表面，分泌胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)，并将自身包裹其中形成的一种有组织的细菌集团，包含多糖、蛋白质、胞外DNA和脂质等，是一个具有三维立体空间结构的生态系。生物膜形式的细菌有了EPS的保护，可以逃避机体免疫系统的攻击以及抗菌药物的杀伤，耐药性增强，同时生物膜还能持续释放细菌，造成感染反复发作并且久治不愈。据报道，形成生物膜的细菌可以呈现出比浮游菌高达1000倍的抗生素耐药，使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染,严重威胁人类和动物健康。因此，急需寻找一种对细菌生物膜作用，尤其是对成熟生物膜的作用的生物活性物质。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用；本专利技术的目的之二在于提供抗微生物肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用；本专利技术的目的之三在于提供抗微生物环肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用；本专利技术的目的之四在于提供抗微生物环肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1.抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述细菌为铜绿假单胞菌。2.抗微生物肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用，所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.抗微生物环肽CRAMP在制备细菌生物膜清除细菌生物膜的药物中的应用，所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述细菌为铜绿假单胞菌。更优选的，所述抗微生物环肽CRAMP的有效剂量浓度大于5μM。4.抗微生物环肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用，所述抗微生物环肽CRAMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。专利技术的有益效果在于：本专利技术合成了抗微生物肽CRAMP及环肽，首次发现对铜绿假单胞菌成熟生物膜有明显的清除作用和抑制形成，且明显优于对照LL-37。由于医学临床中致死率很高的囊性纤维化(Cysticfibrosis，CF)肺炎，根本原因就是铜绿假单胞菌成熟生物膜难以清除，所以该研究对囊性纤维化肺炎治疗及铜绿假单胞菌生物膜的消除策略和机制的深入研究有着十分重要的科学意义和医学临床价值。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为CRAMP和LL-37活菌数和生物膜量结果(A：LL-37；B：CRAMP；折线：生物膜活菌数；柱状图：生物膜量)。图2为环肽CRAMP对铜绿假单胞菌的野生标准株PAO1生物膜的清除作用(折线：生物膜活菌数；柱状图：生物膜量)。图3为不同蛋白酶对CRAMP抗E.coli活性的影响(抑菌圈直径，x±SD，N＝6)(Neutralprotease：中性蛋白酶、Pepsase：胃蛋白酶、Trypsase：胰蛋白酶)。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.a)是一种常见的条件致病菌，是囊性纤维化(Cysticfibrosis，CF)等肺部慢性感染的主要致病菌，也是引起免疫力低下机体慢性反复感染的常见病原体。该菌对多种常见抗生素耐药，感染易反复发作,难以清除，究其原因主要是极易形成BF，并能在动植物中引起广泛的感染，是目前所知种类最多，具有明显生态意义的细菌之一。因此本专利技术实施例以铜绿假单胞菌为例研究对BF具有生物活性的物质。实施例1、CRAMP抗细菌生物膜研究另据报道，LL-37在体外具有明显的抑制P.aeruginosa生物膜形成的作用，同时也观察到LL-37对已经形成的成熟P.aeruginosa生物膜也有一定作用，但是抑制效果有限，所以急需一种对细菌生物膜具有更有效地生物活性物质。CRAMP(CathelicidinRelatedAntimicrobialPeptide)是存在于脊椎动物小鼠的睾丸，脾脏，胃，小肠等器官的生物活性多肽。是哺乳动物AMPs(Antimicrobialpeptides)主要两个家族成员之一的Cathelicidin中的一种，结构以α-螺旋为主，氨基酸序列为：GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ(SEQIDNO.1)。但目前关于CRAMP对细菌生物膜的作用，尤其是对成熟生物膜的作用还未见报道。因此以本专利技术选择CRAMP和LL-37对P.aeruginosa进行生物膜抑制实验，通过结晶紫染色法和活菌计数，观察生物膜内的活菌数和生物膜量，结果如图1所示。结果显示，CRAMP对成熟生物膜具有明显的清除作用，且明显优于对照LL-37。本实施例中合成CRAMP方法如下：具体合成方法如下：合成原料：树脂为取代度为1.03mmol/g的2-ChlorotritylChlorideResin(天津市南开合成科技有限公司)，氨基酸为Fmoc-Phe-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Arg(pbf)-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Ala-OH(成都诚诺，>99％)等。合成试剂：DMF(原产地韩国)，DCM(原产地韩国)，MEOH(原产地日本)，DIEA(新德化工，99％)，HBTU(昊帆生物科技，99％)。脱保护试剂：哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)。检测试剂：苯酚试剂，吡啶试剂，茚三酮试剂。裂解试剂：95％切割液：TFA(J.T.Baker，99％)，TIS(上海达瑞精细化工，98％)，EDT(上海达瑞精细化工，98％)，无水乙醚(上海实验，实测99.7％)。氮气：(新联气体)。仪器：十二通道半自动多肽合成仪(上海强耀生物科技有限公司的半自动多肽合成仪)；SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.SevialSystem，厂商：SHIMADZU)；LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)；离心机(上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B)多肽合成步骤如下：以多肽04010029962为例，合成顺序：从C端到N端。(1)树脂溶涨将2-ChlorotritylChlorideResin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；(2)接第一个氨基酸通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Phe-OH氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min，用甲醇封闭；(3)脱保护去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。(4)检测抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，变深蓝色本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细菌为铜绿假单胞菌。3.抗微生物肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。4.抗微生物环肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红伟，吴俊伟，李晓芬，何星，付贵花，曾杨梅，陈海洪，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50