一种珠子参的组织培养与离体再生方法技术

本发明专利技术公开了一种珠子参的组织培养与离体再生方法，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织的诱导、芽的分化诱导以及生根诱导等步骤。本发明专利技术对珠子参的组织培养及无性系的建立展开了探索，确立了无菌材料的获得、愈伤组织的诱导、愈伤的分化成芽、生根等理想培养条件，最终成功建立了珠子参组培苗的无性繁殖体系，为实现对珠子参野生资源的保护、栽培、对种苗的需求以及基因库的建立奠定了技术基础，解决野生珠子参产量低、供应少和自然栽培周期长的问题。

Tissue culture and regeneration in vitro of Panax japonicus

The invention discloses a method for tissue culture and in vitro regeneration of Panax quinquefolium, which comprises the steps of selection and disinfection of explants, induction of callus, differentiation of buds and rooting induction. The invention explores tissue culture and Clone Establishment of Panax quinquefolium, establishes ideal culture conditions such as obtaining aseptic materials, induction of callus, differentiation of callus into buds and rooting, and finally successfully establishes asexual propagation system of Panax quinquefolium tissue culture seedlings, in order to realize the protection and cultivation of wild resources of Panax quinquefolium. The cultivation, the demand for seedlings and the establishment of gene bank have laid a technical foundation to solve the problems of low yield, low supply and long natural cultivation cycle of wild ginseng.

【技术实现步骤摘要】
一种珠子参的组织培养与离体再生方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种珠子参的组织培养与离体再生方法。
技术介绍
珠子参(Panaxjaponicusvar.major)系五加科人参属多年生草本植物，其根状茎入药为珠子参，具有补肺、养阴、活络和止血的作用，常用于治疗气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血和外伤出血等症。珠子参主要成分是皂苷类化合物，包括竹节参皂苷Ⅴ、Ⅳ、Ⅳa、Ⅳa甲酯，人参皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2及珠子参苷R1、R2等，其中4(R)-珠子参苷R1具有治疗胰岛素抵抗活性，能显著降低肥胖小鼠体重。药理研究表明，珠子参总皂苷具有抗炎、中枢抑制、增强免疫功能、抗脑缺血、抗肿瘤等作用，具有很高的药用价值。在野外，珠子参自然分布集中于2600-3000m高海拔地区，为典型的阴生C3植物，对光、温度等生态因子十分敏感，适应性差，生长适温为16-20℃，生长期夜间温度不低于8℃，喜肥湿润，忌强光直射，耐寒惧高温，自然生境主要为阴湿的针阔叶林、阔叶灌木、竹叶林以及杂灌丛。我国陕西、四川、云南、湖北、甘肃、贵州、西藏等地有其分布，是秦巴山区特色中药材“太白七药”之一。珠子参根状茎呈串珠状，生长周期长，药材更新慢。自然条件下，种子结实率低、不易采收，且胚为后熟类型，有较长的休眠期，采用种子育苗一般需要2年才可移栽，种植4年才能收获。生产中多采用根茎直播繁殖，其根状茎有休眠芽，从愈缩茎的节间处切断，形成独根茎做为繁殖体，4年以上根茎萌芽率低，不宜作为繁殖材料，通常选1-3年生根茎作为繁殖体。近年来随着珠子参药用范围不断扩大，需求量也逐年增加，现有药源远不能满足市场需求。长期以来，珠子参野生资源由于大量采挖早已濒临枯竭，人工种植一直停留在引种驯化栽培初级阶段，种植成本高，产量低。由于种苗的缺乏，珠子参很难实现规模化生产，提高产量。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种方法，即一种珠子参的组织培养与离体再生方法，可实现珠子参组培苗的大量繁殖，解决珠子参种植成本高，产量低的问题。本专利技术采用的技术方案如下：(1)外植体的选择与消毒：选择当年生根茎或者当年新发的幼苗茎段为外植体，用软毛刷在自来水下洗去泥土，再蘸取少量洗洁精刷洗1-2min，自来水下冲洗1-2h，然后置于超净工作台上用75％酒精(体积浓度)消毒8-10s，无菌水冲洗2遍，再用0.1％升汞溶液消毒10-15min，适当摇晃，使外植体与消毒液充分接触，最后倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗6次，洗净备用；(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的外植体在无菌操作下剪切并接种，当年生幼苗的茎段切成1-1.5cm长，圆球形根茎切做两半，接种时平放，以切面接触培养基，两种外植体所接培养基相同，均为愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA0-2.0mg/L+2,4-D0-2.0mg/L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30-40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ0.5-2.0mg/L+NAA0-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(4)生根培养：将步骤(3)中诱导出的珠子参小芽切下，接种至生根培养基中，培养15-20天便开始生根；所述生根培养基为：1/2MS+IBA0.1-2.0mg/L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；上述方法中，步骤(2)、(3)、(4)所用培养基都经过高温湿热灭菌，灭菌条件为121℃/25min；上述方法中，步骤(2)、(3)、(4)的培养条件为：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；上述方法中，步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基优选为：MS+6-BA0.1-2.0mg/L+2,4-D0.5-2.0mg/L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；上述方法中，步骤(3)中所述的芽分化诱导培养基优选为：1/2MS+TDZ1.0-1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；上述方法中，步骤(4)中所述的生根培养基优选为：1/2MS+IBA0.1-1.0mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；本专利技术还提供了一种用于珠子参愈伤组织诱导的培养基，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA0-2.0mg/L+2,4-D0-2.0mg/L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D1.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA0.1mg/L+2,4-D2.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA0.3mg/L+2,4-D0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L。本专利技术的优点在于以珠子参根茎或幼苗茎段为外植体，通过外植体的消毒、愈伤组织的诱导、芽的分化、以及生根培养等过程获得了珠子参离体再生植株，建立了有效的珠子参组培快繁体系，为实现珠子参规模化种植解决种苗问题，提供了一种可行的技术方案。附图说明图1为本专利技术组织培养与离体再生方法获得的珠子参愈伤分化小芽。具体实施方式实施例1(1)外植体的选择与消毒：选择珠子参当年生根茎，在自来水下将泥土洗净，用软毛刷蘸取少量洗洁精刷洗，自来水冲洗2h，放入烧杯中转至超净工作台上，加入75％酒精轻轻摇晃10s，倒掉酒精，无菌水洗2遍，加入0.1％升汞溶液没过外植体，适当摇晃，消毒15min后倒掉升汞，用无菌水清洗6次，洗净备用。(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的珠子参根茎在无菌操作下切成两半，以平放的方式接入愈伤组织诱导培养基，根茎切面与培养基接触，培养20天后，根茎切面边缘开始产生愈伤组织。培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天，培养30天后统计外植体消毒灭菌率和愈伤组织诱导率。所用愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30-40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ1.0mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)外植体的选择与消毒：选择当年生根茎或者当年新发的幼苗茎段为外植体，用软毛刷在自来水下洗去泥土，再蘸取少量洗洁精刷洗1‑2min，自来水下冲洗1‑2h，然后置于超净工作台上用75％酒精(体积浓度)消毒8‑10s，无菌水冲洗2遍，再用0.1％升汞溶液消毒10‑15min，适当摇晃，使外植体与消毒液充分接触，最后倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗6次，洗净备用；(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的外植体在无菌操作下剪切并接种，当年生幼苗的茎段切成1.0‑1.5cm长，圆球形根茎切做两半，接种时平放，以切面接触培养基，两种外植体所接培养基相同，均为愈伤组织诱导培养基：MS+6‑BA 0‑2.0mg/L+2,4‑D 0‑2.0mg/L+NAA 0‑1.0mg/L+蔗糖25‑30g/L+琼脂4‑5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％‑60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30‑40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ 0.5‑2.0mg/L+NAA 0‑0.1mg/L+蔗糖25‑30g/L+琼脂4‑5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％‑60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(4)生根培养：将步骤(3)中诱导出的珠子参小芽切下，接种至生根培养基中，生根培养基为：1/2MS+IBA 0.1‑2.0mg/L+NAA 0‑1.0mg/L+蔗糖25‑30g/L+琼脂4‑5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％‑60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天。...

【技术特征摘要】
1.一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)外植体的选择与消毒：选择当年生根茎或者当年新发的幼苗茎段为外植体，用软毛刷在自来水下洗去泥土，再蘸取少量洗洁精刷洗1-2min，自来水下冲洗1-2h，然后置于超净工作台上用75％酒精(体积浓度)消毒8-10s，无菌水冲洗2遍，再用0.1％升汞溶液消毒10-15min，适当摇晃，使外植体与消毒液充分接触，最后倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗6次，洗净备用；(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的外植体在无菌操作下剪切并接种，当年生幼苗的茎段切成1.0-1.5cm长，圆球形根茎切做两半，接种时平放，以切面接触培养基，两种外植体所接培养基相同，均为愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA0-2.0mg/L+2,4-D0-2.0mg/L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30-40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ0.5-2.0mg/L+NAA0-0.1mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(4)生根培养：将步骤(3)中诱导出的珠子参小芽切下，接种至生根培养基中，生根培养基为：1/2MS+IBA0.1-2.0mg/L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天。2.根据权利要求1所述的一种珠子参的组织培养与...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹进超，左应梅，张金渝，曾琼，杨维泽，曾祥飞，杨天梅，李纪潮，赵文芹，
申请(专利权)人：云南澈川生物科技有限公司，云南省农业科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53