用于提高细胞转染效率的试剂组合物制造技术

本发明专利技术涉及用于提高细胞转染效率的试剂组合物，属于生物技术领域，所述试剂组合物包含化合物BX795 0.01—10μM、化合物Ruxolitinib 0.1—100 μM、化合物Tofacitinib 0.1—100 μM、化合物Actinomycin D 0.1—100 nM中的2种或2种以上物质组成。这些试剂混合液与含有DNA和转染试剂的复合物或包装有目的载体的慢病毒分别加入细胞培养液中，以提高细胞的转染效率。该试剂混合物操作简便、可重复性强，使用范围大，已成功运用于L929、BJ等细胞系和小鼠原代肺纤维细胞、T淋巴细胞等原代细胞中。

Reagent composition for improving cell transfection efficiency

The invention relates to a reagent composition for improving cell transfection efficiency, belonging to the field of biotechnology. The reagent composition comprises compounds BX795 0.01-10 mu M, compounds Ruxolitinib 0.1-100 mu M, compounds Tofacitinib 0.1-100 mu M, and compounds Actinomycin D 0.1-100 nM of two or more substance groups. Yes. The mixture of these reagents and lentiviruses containing DNA and transfection reagents or packaged with targeted vectors were added to the cell culture medium to improve the transfection efficiency. The reagent mixture has been successfully used in L929, BJ cell lines and mouse primary pulmonary fibroblasts, T lymphocytes and other primary cells.

【技术实现步骤摘要】
用于提高细胞转染效率的试剂组合物
本专利技术属于生物
，具体涉及用于提高细胞转染效率的试剂组合物。
技术介绍
基因治疗是当代医学和生物学的一个新的研究领域，其通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。为了达到理想的治疗效果，科学家一直在研究传送质粒DNA的有效途径。目前常规的外源表达系统主要分为两类：一类是采用病毒载体的方式，主流的三种病毒载体包括慢病毒（lentiviral）载体、逆转录（retroviral）病毒载体以及腺病毒（AAV）载体，这些方法是基因治疗等临床试验的主流选择。病毒载体如AAV载体具有高转染率、持续稳定表达外源基因的特点，但其需整合到宿主细胞的染色体中才能够使外源基因得以持续表达,因此具有致癌、致畸的危险。安全性较差这一缺陷已成为限制病毒载体广泛应用的主要原因。另一类是采用非病毒载体的方式。这类非病毒载体安全性高，易于制备，在基因治疗中，从效果和发展前景上看，较病毒载体更具有优越性。但该类载体的导入效率和靶向性较低，较大部分宿主细胞对外源DNA抵抗性强，且外源基因转入到宿主细胞后表达时间短，短暂表达后外源基因快速关闭，这些都严重制约了该类载体的应用与发展。非病毒载体包括脂质体、高分子载体、纳米基因转运体等。对于现有的普通细胞株或原代细胞，一般的转染方法多采用脂质体法和电穿孔的方法。阳离子脂质体表面带正电荷，与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹成DNA-脂质体复合物，能吸附在表面带负电荷的细胞膜，通过膜的融合或细胞内吞作用进入细胞体内。有时也通过细胞膜上小孔的直接渗透作用将DNA传递进入细胞。电穿孔法或电转法，是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将外源分子，如DNA、mRNA、蛋白、糖类等送入宿主细胞的胞浆内。但是对于很多细胞株或原代细胞，外源DNA通过非病毒载体方法进入细胞后并未能完全转录翻译成目的蛋白，表达效率较低，常常达不到实验要求。而通过电击法和病毒法进行转染的效率也不高，且实验操作过程麻烦。如何提高外源DNA在细胞内的表达成为了一个技术难题。在临床治疗方面，治疗造血系统遗传功能障碍的疾病，如联合免疫缺陷（SCID），或治疗癌症的新型手段，如嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）都有赖于一个高效转染T细胞的手段。现今用于原代T细胞进行基因改造的方法主要通过病毒感染和电穿孔的方式进行。病毒法对原代细胞进行感染时，往往需要较高的病毒滴度且通常效果不甚理想。对于T细胞而言，还需要额外的细胞因子，如IL-2和IL-7进行刺激，才能具备一定的病毒感染效率。而电穿孔的方法在操作简易度和实验周期上相比病毒法感染原代细胞更具优势。然而，该法的普及受制于电转效率、细胞存活率、实验仪器差异等诸多因素。加之原代细胞对于多种转染方法都具有较强的抵抗性，使得关于细胞进行高效基因编辑的手段较为匮乏。本文介绍了一组试剂组合物通过对细胞免疫通路的抑制，以提高载体所运载的基因在目标细胞中的表达效率，从而用于基因治疗的临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于提高细胞转染效率的试剂组合物，试剂组合物与含有DNA和转染试剂的复合物或包装有目的载体的慢病毒分别加入细胞培养液中，以提高细胞的转染效率。该试剂混合物操作简便、可重复性强，使用范围大，已成功运用于L929、BJ等细胞系和小鼠原代小鼠成纤维细胞、原代肺纤维细胞、T淋巴细胞等原代细胞中。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：用于提高细胞转染效率的试剂组合物，所述试剂组合物包含：化合物BX795、化合物（鲁索利替尼）Ruxolitinib、化合物托法替布（Tofacitinib）、化合物放线菌素D（ActinomycinD）。其中所述试剂组合物由化合物BX7950.01-10μM、化合物Ruxolitinib0.1-100μM、化合物Tofacitinib0.1-100μM或者化合物ActinomycinD0.1-100nM中的2种或2种以上物质组成。试剂组合物的组合及制备方法，包括如下：1）配制BX795溶液：将10mgBX795加入1.6907mlDMSO中，得到10mMBX795母液；2）配制Ruxolitinib溶液：将5mgRuxolitinib加入0.3260mlDMSO中，得到50mMRuxolitinib溶液；3）配制Tofacitinib溶液：将10mgTofacitinibCitrate加入0.3964mlDMSO中，得到50mMTofacitinibCitrate溶液；4）配制ActinomycinD溶液：将1mgActinomycinD加入79.65μlDMSO中，得到10mMActinomycinD溶液；5）将BX795、Ruxolitinib、Tofacitinib或者ActinomycinD中的任意2种化合物组合配制成特定终浓度的试剂混合液。6）将BX795、Ruxolitinib、Tofacitinib或者ActinomycinD中的任意3种化合物组合配制成特定终浓度的试剂混合液。7）将BX795、Ruxolitinib、Tofacitinib、和ActinomycinD中的4种化合物组合，配制成特定终浓度的试剂混合液，即混合液A。8）所述试剂浓度如下：BX795为0.01-10μM、Ruxolitinib为0.11-100μM、Tofacitinib为0.1-100μM、ActinomycinD0.1-100nM。本专利技术的优点在于：1.本专利技术的方法尤其适用于各贴壁细胞系，原代小鼠成纤维细胞，原代小鼠肺纤维细胞的转染，适用于多种难转染或转染效率低下的细胞系。2.本专利技术的方法适用于多种转染方式，如PEI转染法、Lipofectamine类脂质体系转染法、电转法等3.本专利技术的方法生物毒性小，在血清中稳定，转染效率更高并且操作简单的基因转染辅助试剂。4.本专利技术采用混合物形式配制试剂，其提高转染和表达效果远远优于单一成分的化合物。附图说明图1添加各组分后L929细胞转染GFP荧光效果图。图2免疫印迹法检测混合液A对脂质体转染法转染L929细胞的细胞效率影响。图3两两混合药物对L929细胞的转染效率的影响的荧光效果图。图4三种药物混合对L929细胞的转染效率的影响的荧光效果图。图5混合液A对脂质体转染法转染小鼠肺纤维细胞的荧光效果图及流式细胞分析图。图6混合液A对慢病毒法感染人原代T细胞的荧光效果图。具体实施方式制备该混合液的步骤如下：I.试剂的配制1.母液的配置1）配制BX795溶液：将10mgBX795（购于Selleck公司）加入1.6907mlDMSO中，得到10mMBX795母液；2）配制Ruxolitinib溶液：将5mgRuxolitinib（购于APEXBIO公司）加入0.3260mlDMSO中，得到50mMRuxolitinib溶液；3）配制TofacitinibCitrate溶液：将10mgTofacitinibCitrate（购于APEXBIO公司）加入0.3964mlDMSO中，得到50mMTofacitinibCitrate溶液4）配制ActinomycinD溶液：将1mgActinomycinD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于提高细胞转染效率的试剂组合物，其特征在于：所述试剂组合物包含：BX795、鲁索利替尼、托法替布、放线菌素D。

【技术特征摘要】
1.用于提高细胞转染效率的试剂组合物，其特征在于：所述试剂组合物包含：BX795、鲁索利替尼、托法替布、放线菌素D。2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于：所述试剂组合物由BX795、鲁索利替尼、托法替布和放线菌素D中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈骐，傅雅娟，郑立群，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35