一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗，其中抗原为鸭2型腺病毒和鹅细小病毒，其中鹅细小病毒为GPV‑FJ株病毒；于2018年4月20日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:V201811。鸭2型腺病毒为GD株病毒的保藏编号为CCTCC No：V201633。本发明专利技术制备的二联灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明专利技术中制备的二联灭活疫苗对鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

A 2 inactivated vaccine of goose parvovirus and duck type two adenovirus

The invention provides a geese parvovirus and duck adenovirus type 2 binary inactivated vaccine, in which the antigen is duck type 2 adenovirus and geese parvovirus, in which the geese parvovirus is GPV_FJ strain virus, and is preserved in the China Culture Preservation Center of Wuhan University on April 20, 2018, and the preservation number is CCTCC NO: V20111. The virus number of duck type 2 adenovirus is GD strain CCTCC No:V201633. The binary inactivated vaccine prepared by the invention has good safety and no local and systemic adverse reactions caused by the vaccine are found. The immune effect of the vaccine was evaluated by serological method and immune attack method, and the results showed that the bi-inactivated vaccine prepared by the invention could provide effective immune protection for ducks, and had a good quotient. The future of product development.

【技术实现步骤摘要】
一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗。
技术介绍
腺病毒是家禽常见的传染性病原体。禽腺病毒分为三个群：Ⅰ群是从鸡、火鸡、鹅和鸭的呼吸道感染分离出来的禽腺病毒，有共同的群特异性抗原，可分为A、B、C、D、E5个种和12个血清型；Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒、雉大理石皮病病毒和鸡大脾病病毒；Ⅲ群是从鸡产蛋综合征和鸭分离到的腺病毒。鸭2型腺病毒属于Ⅰ群禽腺病毒，是1977年法国匈牙利人从患病番鸭上分离出来的，感染鸭主要表现精神沉郁，下痢，消瘦等症状。主要有传播方式决定的，即水平传播和垂直传播，病毒一旦带入鸭群很难清除。鹅细小病毒病是由鹅细小病毒引起的一种急性传染病，主要侵害1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，以发生渗出性肠炎为主要病理变化，发病急，死亡率高，传播快为特点。发病率和死亡率随着日龄的增加而下降，主要侵害7日龄以内的雏鹅和雏番鸭，死亡率可达100％，10日龄以上者死亡率一般不超过60％，20日龄以上的发病率低。根据发病情况分为3种类型，最急性型，急性型和亚急性型。1974年世界禽类学会为纪念Derzs的先期工作而将此病命名为Derzsy氏病。近年来，我国养鸭业发展迅速，尤其是散养户较多，一些养鸭设施简陋，消毒意识淡薄及环境卫生不到位等原因，疾病流行情况复杂造成一些新的变异株及不同血清型毒株出现。在我国的一些省、市、自治区均有流行,南方地区的番鸭尤为突出，给番鸭养殖业造成严重的经济损失。通过对两种病的流行病学调查，发现这两种病在我国番鸭群中发病率日益上升趋势。基于目前，国内外预防这两种病的商品化灭活疫苗免疫效果都不是很好，个别鸭场仍然出现发病现象，甚至出现死亡，可能与病毒的变异有关，需要筛选变异的病毒株来制备疫苗。另外，单苗的多针多剂量，给鸭群带来一些不必要的应激反应。研制安全有效的二联灭活疫苗迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗，能够有效预防鸭2型腺病毒和番鸭源鹅细小病毒病。本专利技术提供的鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联疫苗，其中抗原为鸭2型腺病毒和鹅细小病毒，其中鹅细小病毒为GPV-FJ株病毒；于2018年4月20日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:V201811。作为实施例的具体记载，所述的鸭2型腺病毒为GD株病毒；于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：V201633。所述的疫苗为灭活疫苗。上述的灭活疫苗，其中鸭2型腺病毒和番鸭源鹅细小病毒的灭活采用甲醛灭活，疫苗中鸭2型腺病毒的病毒含量≥106.5TCID50/0.1ml，番鸭源鹅细小病毒的病毒含量≥105.0ELD50/0.2ml。本专利技术的二联灭活疫苗的制备方法是将GD株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16小时，GPV-FJ株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16小时，灭活检验后把两种抗原(GD株与GPV-FJ株)按照体积比0.8∶1～1∶1混合，加入Tween-80制备水相，溶解后的水相与白油佐剂1∶2混合乳化，得到鸭2型腺病毒和鹅细小病毒病二联灭活疫苗。本专利技术制备的鸭2型腺病毒和鹅细小病毒病二联灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本专利技术中制备的二联灭活疫苗对鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。附图说明图1为鹅细小病毒病毒GPV-FJ株的PCR检测结果，其中，M为2000DNAMarker、1为PCR扩增结果、2为阴性对照；图2为鹅细小病毒病毒GPV-FJ株的进化树图；图3为鹅细小病毒病毒GPV-FJ株的基因的同源性比较；具体实施方式专利技术人筛选了鸭2型腺病毒GD株和番鸭源鹅细小病毒GPV-FJ株，这两株均是变异株，从而促成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1毒株的分离与鉴定1.1GD株的分离与鉴定1.1.1GD株的病毒分离2015年专利技术人成功从广东某养鸭场的番鸭群中分离出一株鸭2型腺病毒。取病番鸭的肝脏、脾脏、肾脏等的组织研磨，与无菌PBS匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液加入青链霉素，4℃过夜，经过滤无菌检验合格后保存备用。将含1％病毒过滤液接种番鸭胚成纤维细胞，无血清的M199培养液进行培养，37℃静置培养60～78小时，可出现明显的细胞病变，收集病毒液。1.1.2病原学的鉴定将收集的病毒液经纯化进行了氯仿处理、血凝性鉴定、理化特性检验、病毒含量测定、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测。结果表明：该病毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。该病毒没有囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。而经氢氧化钠(pH＝10)和温度(50℃、1小时)处理后，接种细胞，无细胞病变，PCR检测阴性。表明分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1小时可被灭活。该毒株病毒含量为107.50TCID50/0.1ml。该病毒与GD株阳性血清中和组中和指数远高于流行株阳性血清，说明该病毒与GD株血清发生特异性中和反应且中和效价有差异。该病毒无细菌、支原体及外源病毒污染。1.1.3分子生物学鉴定将分离到的病毒进行PCR检测、基因测序、同源性分析。经PCR检测和Hexon基因测序，通过NCBIBLAST比对分析，分离株Hexon基因与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与GenBank数据库中GR株(登录号：NC_024486.1)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.02％和99.70％。GD株与GR株的Hexon所编码的氨基酸六个位点不同。GD株与GenBank数据库中I群禽腺病毒的部分核苷酸同源性为31％～88％。1.2GPV-FJ株的分离与鉴定1.2.1流行病学调查2017年5月，福建某番鸭场的8日龄番鸭群出现呼吸症状，即发病初期。番鸭场在1日龄时免疫商品化鸭肝炎二价抗体和鹅细小病毒灭活疫苗，8日龄出现脚软，个别鸭有出现死亡，使用抗菌素，没有好转，并且死亡率逐日增加。死亡鸭解剖发现渗出性肠炎、肠道内形成腊肠样栓子为主要的病理变化。全身脱水心肌充血，肝脏和脾脏肿大等。经实验室诊断为鹅细小病毒的变异株。1.2.2病毒分离取患病白番鸭的脑、内脏、肠道等病变的组织50～100g，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒)，按1∶5(w/v)比例与无菌PBS匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经0.22μm微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。1.2.3病毒的鉴定将收集的病毒液经纯化进行了氯仿处理、血凝性鉴定、理化特性检验、病毒含量测定、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测。病毒继代发现培养特性比较稳定，死亡番鸭胚可见胚体头部、颈部及绒毛尿囊膜有明显水肿，全身有出血，变化特征明显。收集48h～144小时尿囊液离心、过滤作为抗原。该病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联疫苗，其特征在于，所述的二联疫苗，其中抗原为鸭2型腺病毒和鹅细小病毒，其中鹅细小病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201811。

【技术特征摘要】
1.一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联疫苗，其特征在于，所述的二联疫苗，其中抗原为鸭2型腺病毒和鹅细小病毒，其中鹅细小病毒的保藏编号为CCTCCNO:V201811。2.如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的鸭2型腺病毒为GD株病毒；其保藏编号为CCTCCNo：V201633。3.如权利要求1或2所述的二联疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。4.如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的鸭2型腺病毒和番鸭源鹅细小病毒的灭活采用甲醛灭活。5.如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王相芹，王丹娜，刘阳，谭鹏，王学波，刘志亮，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37