用于治疗心脏病况和其他病理的从单个载体表达多种生物活性多肽的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了可用于通过引入多基因表达载体来治疗可被治疗的病症的组合物和方法。更具体地，本发明专利技术提供了编码用于治疗心脏病症的多肽的载体和多核苷酸，其中所述多肽可包含细胞因子、趋化因子和/或血管生成多肽或其功能性衍生物。作为本发明专利技术的组合物，还提供了可用于连接和从单个多基因表达构建体表达功能性(生物活性)多肽的连接体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗心脏病况和其他病理的从单个载体表达多种生物活性多肽的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年11月11日提交的美国临时专利申请号62/254,139的权益，该美国临时专利申请通过引用以其全文并入于此。参考序列表本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且通过引用以其全文并入于此。在2016年11月11日创建的所述ASCII副本被命名为INX00339WO_20161111_SL.txt并且大小为271,843个字节。
本专利技术提供了新的核酸和载体以及由其编码的多肽，它们用于疾病、病症和病理性病况的多基因治疗。更具体地说，本专利技术提供了用于多基因治疗和预防心脏疾病和病症的新的核酸、载体、多肽和方法。此外，本专利技术提供了新的核酸和多肽连接体，其提供了有利的从核酸和载体的蛋白质表达，可用于疾病、病症和病理性病况的多基因治疗。
技术介绍
心脏疾病乃重要的未被满足的医疗需求；据估计，全球至少有2500万名患者。此外，根据美国(U.S.)政府疾病控制和预防中心(CDC)截止2013年的“心力衰竭情况说明书”，美国有超过500万人患有心力衰竭病况。据估计，在每年多达825,000例新发病例的情况下有1/9死于心力衰竭。诊断后5年的平均生存率约为40％，并且再入院率在任何诊断相关组中为最高。据估计，美国每年的支出高达320亿美元。心力衰竭治疗选择包括药物治疗、侵入性装置和心脏移植。充血性心力衰竭(CHF)描述了心脏无法提供足够的心脏输出来供应身体的代谢需求。全球目前有超过2200万人被诊断为CHF，并且在美国有超过500万名患者。由于心脏疾病的发病率和严重程度随着年龄的增长而增加，预计未来由于人口老龄化而总体发病率上升。CHF患者的预后仍然不佳，其中五年死亡率为50％。根据美国心脏协会(AHA)的统计，2013年美国心血管疾病夺去810,000个生命，其中每3例报告的死亡病例中约占1例。终末期心力衰竭的药理学管控着眼于如下三个目标：1)改善发病率和死亡率(ACE抑制剂、血管紧张素II型I受体拮抗剂、选择的β受体阻滞剂和醛固酮拮抗剂)；2)控制症状(利尿剂(最终噻嗪加袢利尿剂)、洋地黄(低剂量)；暂时性正性肌力药(inotropes)和选定的抗心律失常药)；和3)缓解(阿片类药物、抗抑郁药、抗焦虑药、氧气和持续的正性肌力药)。然而，随着疾病的进展，治疗选择仅限于心脏再同步化疗法(CRT)；考虑植入式心脏复律除颤器(ICD)；心脏移植和心室辅助装置(VAD)，它们既用作移植的桥梁，也越来越多地由于缺乏供体心脏而用作终极疗法。虽然接受三联免疫抑制疗法的心脏移植患者的总体5年生存率为70-80％，但作为治疗选择的心脏移植受到供体心脏持续短缺、移植候选人数量渐增以及每年的年度高支出超过100,000美元的限制。由机械辅助循环支持跨机构登记处(INTERMACS)收集的数据显示，在2006年6月23日至2013年6月30日期间，12,335名患者接受了FDA批准的耐用机械循环支持(MCS)装置，其中自然增长率已经连续达到每年2000名患者的速度。用于CHF治疗的细胞及基因疗法的研究越来越多，但是由于存在生物效应、细胞保留、递送时机以及缺乏机制或有限的单基因效应方面的问题而难有结果。即便如此，许多临床基因疗法试验在一年内都表现出一定的效果。尽管基因疗法具有确定的作用机制，但用于改善血管生成、干细胞归巢或收缩变力性的单个基因还不足以治疗CHF。由于CHF在瘢痕形成、收缩功能下降和细胞损失方面受多因素影响，因此多基因方法在保持这些重病患者安全的同时可更好地应对这些单个因素。传统上，用于基因疗法的载体是单基因。近年来对更复杂的多基因载体的需求不断增加。具体而言，癌症和抗病毒治疗的联合疗法的需要刺激了该需求。联合基因疗法是药物预防癌症突变和抗性的最佳尝试。通过组合两种或三种药剂，可以获得更完整和有效的应答。援引并入本文中所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。如果本文公开内容与并入的参考文献中的公开内容之间存在冲突，则以本文中的公开内容为准。
技术实现思路
越来越多的充血性心力衰竭(CHF)患者的治疗选择仍较为有限。例如，常见的CHF治疗导致放置目标左心室辅助装置(LVAD))。因此，需要通过不同方法来提供用于促进从CHF康复的生物学选择。在具有独特基因突变(即肌钙蛋白I或重链肌球蛋白)的患者中，基于单基因的心脏疾病治疗方法是可行的。然而，在大多数具有心脏病理的患者中，终末期疾病是由多种因素引起的。因此，在这类情况下，单基因方法有可能不起作用。心脏病患者通常具有需要通过细胞募集和/或血管生成进行正性重塑的瘢痕组织。它们通常还需要通过钙或其他途径增加肌力作用。因此，将影响钙处理、细胞募集和血管生成的基因组合在一起为治疗和恢复这些终末期CHF患者提供了更合适的途径。此外，当考虑基于基因的方法来治疗心脏病症(例如但不限于CHF)时，使用病毒载体可以对抗人免疫系统，或者患者可能已经具有预先形成的抗病毒抗体(例如，抗AAV1/AAV2抗体)，其可能导致安全性和有效性问题。因此，使用在人体中具有低至无有害免疫应答且可根据需要重新给药的质粒DNA成为治疗性基因递送的有益模式。正因为如此，本专利技术的一个实施方案提供了用于治疗性治疗心脏疾病和病症(例如但不限于CHF)的基于三效应物非病毒质粒的DNA。在一个实施方案中，本专利技术提供了基于三效应物非病毒质粒的DNA载体(构建体)。在本专利技术的特定实施方案中，称为pXoX的表达质粒编码并表达生物活性SDF1α、S100A1和VEGF，其中这三种感兴趣的效应物基因(GOI)通过本文所述的选择性设计的连接体序列分开。治疗心脏疾病和病症(例如但不限于CHF)的多基因质粒DNA方法基于来自其他研究(其中已使用单基因)的体外阳性、临床前和临床数据。下面描述的每种感兴趣的基因对于收缩力(inotropy)(例如，S100A1)、细胞归巢(例如，SDF-1α)和血管生成(例如，VEGF165)具有特异性功能。包含全部三种基因的单质粒构建体而不是在分别递送的质粒上的每个单独基因，其基本原理是，如果将单基因(在单独分开的载体上)递送至细胞，则不存在可以控制将每个基因转染至细胞的量的方法。尽管比本专利技术的单个多基因构建体相比更为简单，但基因递送的这种可变性将使得该疗法不够安全并且不可重复。因此，在一个实施方案中，载体如pXoX组成型表达S100A1(细胞内蛋白质)、SDF-1α(分泌的蛋白质)和VEGF165(分泌的蛋白质)。使用pXoX，pDNA构建体被转录为单个mRNA，该单个mRNA通过弗林蛋白酶和P2A(fp2a)的组合活性经由切割被翻译为三个单独的功能性蛋白质。2A自切割肽编码介导被称为“核糖体跳跃”、“停止-前进”和“终止-进行”翻译的翻译效应的序列(P2A)，该翻译效应导致在单个启动子的控制下从单个转录物mRNA共同表达多种蛋白质。组成型表达由例如但不限于CAG启动子(包含具有CMV增强子和杂合CBA外显子1/兔β-珠蛋白内含子B的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的杂合启动子)的启动子驱动。以下所述为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸，其编码包含S100钙结合蛋白(S100)多肽和第二功能性多肽的多肽构建体，其中所述第二功能性多肽为细胞因子、趋化因子、血管生成多肽及其任何功能性衍生物中的至少一种。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.11 US 62/254,1391.一种多核苷酸，其编码包含S100钙结合蛋白(S100)多肽和第二功能性多肽的多肽构建体，其中所述第二功能性多肽为细胞因子、趋化因子、血管生成多肽及其任何功能性衍生物中的至少一种。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述S100多肽为S100A1，其片段或变体。3.根据权利要求1至2中任一项所述的多核苷酸，其中所述第二功能性多肽为血管生成多肽。4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述血管生成多肽为血管内皮生长因子(VEGF)多肽。5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206，其片段和变体。6.根据权利要求4至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。7.根据权利要求4至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。8.根据权利要求1至2中任一项所述的多核苷酸，其中所述第二功能性多肽为趋化因子。9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述趋化因子为基质细胞衍生因子1(SDF)多肽。10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。11.根据权利要求9至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。12.根据权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述S100多肽通过第一多肽连接体连接至所述第二多肽。13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述连接体为可切割的连接体。14.根据权利要求1至13中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽构建体进一步包含第三功能性多肽。15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽为细胞因子、趋化因子、血管生成多肽及其任何功能性衍生物中的至少一种。16.根据权利要求14至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽为血管生成多肽。17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述血管生成多肽为VEGF多肽。18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206及其片段或变体。19.根据权利要求17至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。20.根据权利要求17至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。21.根据权利要求14至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽为趋化因子。22.根据权利要求21所述的多核苷酸，其中所述趋化因子为SDF多肽。23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。24.根据权利要求22至23中任一项所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。25.根据权利要求14至24中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽通过任选可切割的第二多肽连接体连接至所述S100多肽和所述第二功能性多肽中的至少一个。26.根据权利要求12至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一和第二多肽连接体独立地选自由fp2a、p2a、GSG-p2a和fmdv组成的列表。27.由权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。28.一种细胞，其包含权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸。29.一种治疗心脏病况的方法，其包括使细胞与治疗有效量的权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸相接触。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞为心肌细胞。31.一种治疗受试者中的心肌病的方法，其包括向所述受试者提供治疗有效量的包含权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸的组合物。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。33.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述受试者用至少一种附加疗法进行治疗。34.一种药物组合物，其包含权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的多肽以及药学上可接受的赋形剂。35.一种多核苷酸，其编码包含至少第一多肽和第二多肽的至少一种多肽构建体，其中：i.所述第一多肽为血管生成多肽；ii.所述第二多肽为趋化因子或其变体或片段。36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述血管生成多肽为VEGF多肽，该VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体。37.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。38.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。39.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述第二多肽为SDF多肽。40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。41.根据权利要求39至40中任一项所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。42.一种改善受试者中的血管发生的方法，其包括向所述受试者提供治疗有效量的组合物，该组合物包含权利要求35至41中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的多肽。43.一种表达载体，其包含与选自SDF1多肽、S100A1多肽、VEGF多肽及其片段和变体的至少两种多肽可操作地连接的至少一种启动子。44.根据权利要求43所述的表达载体，其中所述至少两种多肽通过连接体连接。45.根据权利要求43至44中任一项所述的表达载体，其中所述至少一种启动子选自CAG启动子、CMV启动子、SV40启动子、腺病毒启动子、β肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、EF1a启动子、肌球蛋白轻链启动子、肌球蛋白重链启动子和NCX1启动子。46.根据权利要求43至45中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体为心脏表达载体。47.一种包含至少第一多肽和第二多肽的多肽构建体，其中：i.所述第一多肽为钙结合蛋白或其变体或片段；ii.所述第二多肽为血管生成多肽、趋化因子或其变体或片段。48.一种包含至少第一多肽、第二多肽和第三多肽的多肽构建体，其中：i.所述第一多肽为血管生成多肽或其变体或片段；ii.所述第二多肽为趋化因子或其变体或片段；并且iii.所述第三多肽为钙结合蛋白或其变体或片段。49.根据权利要求47至48中任一项所述的构建体，其包含S100A1、其变体或片段。50.根据权利要求47至49中任一项所述的构建体，其包含SDF1、其变体或片段。51.根据权利要求47至50中任一项所述的构建体，其包含VEGF、其变体或片段。52.一种复合物，其包含与至少一种受体复合的权利要求47至51中任一项所述的构建体。53.一种药物组合物，其包含权利要求47至51中任一项所述的构建体和药学上可接受的赋形剂。54.一种治疗受试者中的心肌病的方法，其包括向所述受试者提供治疗有效量的包含权利要求47至51中任一项所述的构建体的组合物。55.一种方法，其包括：使至少一个心脏细胞与编码包含至少第一多肽和第二多肽的多肽构建体的多核苷酸相接触，其中：所述第一多肽为血管生成多肽变体或其片段；并且所述第二多肽为趋化因子、钙结合蛋白或其变体或片段中的至少一种。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述血管生成多肽变体或其片段为VEGF多肽，该VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。58.根据权利要求56所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述第二多肽为趋化因子。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述趋化因子为基质细胞衍生因子1(SDF)多肽。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。62.根据权利要求60至61中任一项所述的方法，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。63.根据权利要求55至62中任一项所述的方法，其中所述编码多肽的多核苷酸是离体引入的。64.根据权利要求55至62中任一项所述的方法，其中所述编码多肽的多核苷酸是体内引入的。65.根据权利要求64所述的方法，其中所述体内引入选自经皮冠状动脉导管插入、冠状静脉阻塞、心脏再循环、顺行冠状动脉输注、逆行灌注、直接注射、超声靶向微泡破坏及其任何组合。66.根据权利要求55至65中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少一种附加疗法。67.一种改善受试者中的血管发生的方法，其包括：向所述受试者施用一定量的编码包含SDF多肽和S100多肽中的至少一种以及VEGF多肽的构建体的多核苷酸。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体。69.根据权利要求68所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。70.根据权利要求68所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。71.根据权利要求67至70中任一项所述的方法，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。72.根据权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述S100多肽为S100A1、其片段或变体。73.根据权利要求67至72中任一项所述的方法，其中所述受试者患有心肌病。74.根据权利要求73所述的方法，其中所述心肌病选自扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、致心律失常性右室心肌病(ARVC)及其任何组合。75.一种治疗或预防受试者中的心血管病况的方法，其包括：向所述受试者施用一定量的包含S100A多肽和第二功能性多肽的构建体，其中所述第二功能性多肽为细胞因子、趋化因子和血管生成多肽中的至少一种。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述施用是预防性进行的。77.根据权利要求75所述的方法，其中所述施用是治疗性进行的。78.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种附加治疗。79.根据权利要求75至78中任一项所述的方法，其中所述第二功能性多肽为VEGF、SDF或其组合。80.一种基因治疗方法，其包括向受试者施用至少一种非病毒载体，该非病毒载体包含：a.至少两种编码功能性蛋白质或其部分的基因；b.至少一种启动子；和c.至少一个工程化重组位点；其中所述至少一种启动子驱动所述至少两种基因的表达。81.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一种启动子是组成型的。82.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一种启动子是组织特异性的。83.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一种启动子是诱导型的。84.根据权利要求82所述的方法，其中所述至少一种组织特异性启动子为肌球蛋白轻链(MLC)启动子。85.根据权利要求83所述的方法，其中所述诱导型启动子为基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮激素受体的基因开关。86.根据权利要求83或85所述的方法，其中所述诱导型启动子利用配体对所述至少两种基因的表达进行剂量调节的控制。87.根据权利要求86所述的方法，其中所述配体选自蜕皮类固醇、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N,N’-二酰基肼、噁二唑啉、二苯甲酰基烷基氰基肼、N-烷基-N,N’-二芳酰基肼、N-酰基-N-烷基羰基肼、N-芳基-N-烷基-N’-芳基肼、氨基酮、3,5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1,1-二膦酸酯、保幼激素III、RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)及其任何组合。88.根据权利要求80至87中任一项所述的方法，其中所述连接体为可切割的连接体。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述连接体包含序列APVKQ(SEQIDNO:42)、GPVKQ(SEQIDNO:43)、VPVKQ(SEQIDNO:44)、IPVKQ(SEQIDNO:45)、MPVKQ(SEQIDNO:46)、APIKQ(SEQIDNO:47)、GPIKQ(SEQIDNO:48)、VPIKQ(SEQIDNO:49)、IPIKQ(SEQIDNO:50)、MPIKQ(SEQIDNO:51)、APAKQ(SEQIDNO:52)、GPAKQ(SEQIDNO:53)、VPAKQ(SEQIDNO:54)、IPAKQ(SEQIDNO:55)、MPAKQ(SEQIDNO:56)、APVRQ(SEQIDNO:57)、GPVRQ(SEQIDNO:58)、VPVRQ(SEQIDNO:59)、IPVRQ(SEQIDNO:60)、MPVRQ(SEQIDNO:61)、APIRQ(SEQIDNO:62)、GPIRQ(SEQIDNO:63)、VPIRQ(SEQIDNO:64)、IPIRQ(SEQIDNO:65)、MPIRQ(SEQIDNO:66)、APARQ(SEQIDNO:67)、GPARQ(SEQIDNO:68)、VPARQ(SEQIDNO:69)、IPARQ(SEQIDNO:70)、MPARQ(SEQIDNO:71)、APV...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪姆基·S·帕特尔，艾米特·N·帕特尔，
申请(专利权)人：英特拉克森公司，
类型：发明
国别省市：美国,US