采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法技术

本发明专利技术提供采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，属生物制药技术领域。该方法包括采用海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16的保藏号为CCTCC NO：M 2013154。本发明专利技术采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，转化率高，由于该方法利用微生物胞内酶进行催化，因此不易失活且可以重复使用，产物易于分离纯化，显著降低成本。

Preparation of glycosylated Puerarin by microbial cells

The invention provides a method for preparing glycosylated Puerarin by microbial cells, belonging to the technical field of biopharmaceuticals. The method includes the steps of glycosylation of Puerarin by Microbacterium thalassium NJ16 in non-aqueous phase, and the preservation number of Microbacterium thalassium NJ16 is CCTCC NO: M 2013154. The method of preparing glycosylated Puerarin by microbial cells has high conversion rate. Because the method uses microbial intracellular enzymes for catalysis, it is not easy to inactivate and can be reused, the product is easy to be separated and purified, and the cost is remarkably reduced.

【技术实现步骤摘要】
采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法
本专利技术属生物制药
，具体涉及采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法。
技术介绍
葛根素是从豆科植物野葛等植物中提取的异黄酮葡萄糖碳苷，是中药葛根的主要活性成分之一，具有如降血压、抗肿瘤和抗氧化等多种生物活性，其分子式为C21H20O9，分子量为416.4。由于葛根素的水溶性较低（6.24g/L），通过结构修饰进行糖基化，可提高其溶解度。如：蒋洁蓉等（JiangJR,YuanS,DingJF,etal.ApplMicrobiolBiotechnol,2008,81,647-657.）以氧化微杆菌糖基化葛根素，得到7-O-葡萄糖苷葛根素（CASRN：1163249-06-6）与7-O-异麦芽糖苷葛根素（CASRN：1163249-07-7），转化率分别为40%和5%。通过生物转化对天然产物进行结构修饰，具有转化反应条件温和，转化产物简单易分离等优点，糖基化修饰后，化合物溶解度可显著提高。但是，现有技术中，通过生物转化法制备糖基化葛根素，还存在转化率不高，胞外酶易失活不能重复使用，成本较高等问题。
技术实现思路
本专利技术目的是提供采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，转化率高，由于该方法利用微生物胞内酶进行催化，因此不易失活且可以重复使用，产物易于分离纯化，显著降低成本。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，包括采用海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16的保藏号为CCTCCNO：M2013154。优选的技术方案中，所述糖基供体为蔗糖。在本专利技术中反应溶剂是亲水性有机溶剂和pH为4.0~9.0缓冲液的混合物，所述亲水性有机溶剂的体积百分含量为10%~30%，所述亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇中的一种或者两种以上的混合物。优选的技术方案中，海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16固定化后在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应；所述固定化方法如下：将海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀，再滴至CaCl2溶液中，得到固定化细胞；所述海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16悬浮液的OD680为4.0-6.0，CaCl2溶液的浓度为10-40g/L，海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合后海藻酸钠的浓度为10-50g/L；固定化细胞包埋量为20~60%。优选的技术方案中，转化体系中，葛根素的浓度为5~80g/L，蔗糖的浓度为50~500g/L；固定化细胞与转化体系的体积比为5～50:100，所述转化体系是在反应溶剂中添加葛根素和蔗糖后形成的；反应温度为15~45℃，反应时间为1~36h。优选的技术方案中，海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16采用发酵培养基在20~40℃发酵培养6~24h，所述发酵培养基含有如下成分：蔗糖5~40g/L，酵母粉2~30g/L，KH2PO40.5~5g/L，MgSO40.1~2g/L，pH6~8。在本专利技术中，糖基化葛根素采用如下方法纯化：反应结束后，过滤收集固定化细胞，采用AB-8型大孔树脂层析分离滤液中的糖基化葛根素。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果在于：本专利技术提供了采用海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16制备糖基化葛根素的方法，该菌株能够产生催化葛根素糖基化反应的胞内酶，因此催化酶不易失活、易于重复使用，产物易于分离。申请人巧妙的将固定化技术与非水相体系相结合，不仅实现了糖基化葛根素的高效制备，而且产物易于分离，微生物细胞能够重复使用，显著降低了生产时间和成本。附图说明图1果糖基-β(2,6)-葛根素的分子结构。图2显示了果糖基-β(2,6)-葛根素的H-HCOSY谱图。图3显示了果糖基-β(2,6)-葛根素的C-HHSQC谱图。图4显示了果糖基-β(2,6)-葛根素的HMBC谱图。具体实施方式下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制专利技术的范围。实施例1生产糖基化葛根素的微生物的筛选及鉴定从本实验室保存的多株菌中筛选生产糖基化葛根素的微生物，其中包括海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16。发酵培养基：蔗糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0。生产糖基化葛根素的菌种的筛选：取各菌株的平板培养物，以发酵培养基培养12h后，取发酵液5mL，加入到150mL带塞三角瓶中，另外加入底物溶液（其中含DMSO20%(v/v)，葛根素20g/L，蔗糖100g/L）至总体积达到20mL，于30℃、160r/min条件下转化24h，转化液样品以HPLC检测。HPLC检测结果，显示海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16具有较高的糖苷化芒果苷活性。菌种鉴定：以通用方法提取海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16的基因组，进行16SrDNA片段PCR扩增、纯化及序列测定。以测序的16SrDNA序列利用BLAST程序与GenBank数据库进行相似性比较分析，再次证实菌株NJ16为海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）。该菌株已送中国典型培养物保藏中心进行专利菌种保藏，保藏信息如下：分类命名为海洋微杆菌NJ16MicrobacteriumthalassiumNJ16，保藏日期为2013年4月22日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2013154。实施例2制备海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16固定化细胞配制发酵培养基：蔗糖25g/L，酵母粉10g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO40.3g/L，pH7.0。将40ml发酵培养基装入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min后，接种海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16，于30℃、180rpm振荡发酵培养12小时，所得发酵液作为种子液接种至5L发酵罐中，发酵罐中发酵培养基装液量70%，接种量3%；然后在30℃、搅拌转速300rpm条件下发酵培养，通气量3vvm，发酵培养6小时。将发酵液在5000r/min离心10min，收集细胞并以生理盐水重新悬浮，调节OD680nm为4.5。配制60g/L的海藻酸钠溶液，将其放入高压灭菌锅中在121℃温度下灭菌20min，然后放入已灭菌的无菌操作台中冷却至室温。取以上配制的海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液按体积比为3:7混合均匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至35g/L的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，其特征在于包括采用海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16的保藏号为CCTCC NO：M 2013154。

【技术特征摘要】
1.采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，其特征在于包括采用海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16的保藏号为CCTCCNO：M2013154。2.根据权利要求1所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于所述糖基供体为蔗糖。3.根据权利要求1或2所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于反应溶剂是亲水性有机溶剂和pH为4.0~9.0缓冲液的混合物，所述亲水性有机溶剂的体积百分含量为10%~30%，所述亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇中的一种或者两种以上的混合物。4.根据权利要求3所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16固定化后在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应；所述固定化方法如下：将海洋微杆菌（Microbacteriumthalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀，再滴至CaCl2溶液中，得到固定化细胞；所述海洋微杆菌（Microbacteriumt...

【专利技术属性】
技术研发人员：许婷婷，吴薛明，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32