识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂及其CAR-T细胞制剂制造技术

本发明专利技术涉及单链抗体的核苷酸序列和氨基酸序列，其可特异识别人c‑Met蛋白。基于该单链抗体，可获得特异性地识别c‑Met阳性的肿瘤细胞的融合蛋白。体外实验证明此融合蛋白可介导补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞毒作用；当注入到荷瘤小鼠体内，可杀伤肿瘤细胞;基于此单链抗体，构建了识别c‑met的嵌合抗原受体(CAR)，并制备和扩增了CAR‑T细胞。该c‑Met CAR‑T细胞可特异识别c‑Met表达阳性的人源肿瘤细胞并体外有效杀伤；当此c‑Met CAR‑T细胞注入到荷瘤小鼠体内，表现出特异识别c‑Met的，对肿瘤细胞生长抑制的治疗效果。

Human scFv, diagnostic reagents and CAR-T cell preparations for identifying human c-Met protein

The present invention relates to nucleotide sequence and amino acid sequence of single chain antibody, which can specifically recognize human c_Met protein. Based on the scFv, fusion protein of C Met positive tumor cells can be specifically identified. In vitro experiments showed that the fusion protein could mediate complement-dependent cytotoxicity and antibody-dependent cytotoxicity; when injected into tumor-bearing mice, it could kill tumor cells; based on this single-chain antibody, a chimeric antigen receptor (CAR) recognizing c_met was constructed, and CAR_T cells were prepared and amplified. The c_Met CAR_T cells could specifically recognize human tumor cells with positive expression of c_Met and kill them effectively in vitro. When c_Met CAR_T cells were injected into tumor-bearing mice, the cells showed specific recognition of c_Met and showed therapeutic effect on tumor cell growth inhibition.

【技术实现步骤摘要】
识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂及其CAR-T细胞制剂
本专利技术涉及生物技术
，尤其涉及识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂以及其CAR-T细胞制剂。
技术介绍
癌症是威胁人类健康的常见疾病。目前临床上普遍应用的癌症治疗方法包括外科手术及放疗/化疗等。由于这些方法不能精准地区分肿瘤和周围的正常组织。因此，不可避免地对机体造成损失和破坏，引起严重的副反应，特别是一些处于发展晚期及发生转移的肿瘤。人类社会迫切需要更加有效，安全，及特异针对肿瘤组织的治疗手段及方法。受体酪氨酸激酶c-Met及其唯一的已知配体HGF(hepatocytegrowthfactor)在细胞的增殖、存活、侵袭、组织发育及器官再生等过程中扮演重要作用。HGF同c-Met可以形成一个紧密复合体，并启动信号转导过程。活性复合体的形成，会导致受体的多聚化、内吞、胞内激酶结构域中多个酪氨酸残基的磷酸化，从而激活多条信号级联通路，并与肿瘤的发展、侵袭及转移密切相关。尽管HGF/c-met信号通路存在着严格的调控，但在多种类型的恶性肿瘤中均检测到了该信号通路的异常调节。C-MET的异常激活可通过非HGF依赖性机制发生，如met基因的突变、基因扩增及转录水平上调等。C-met的过表达发生于多种类型的实体瘤中，包括脑肿瘤、乳腺癌、大肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、前列腺癌与软组织癌等。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术实施例提供一种特异性识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂以及其CAR-T细胞制剂，旨在解决现有技术中，癌症治疗技术手段特异性不佳的技术问题。为解决上述技术问题，本专利技术实施例提供以下技术方案：一种人源单链抗体，其中，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的核苷酸序列为SEQID1；所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQID2。一种人源单链抗体，其中，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列为SEQID3；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQID4。一种DNA序列，其中，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和人IgGFc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如上所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID5。一种DNA序列，其中，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和鼠IgG2aFc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如上所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID7。一种DNA序列，其中，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和兔IgGFc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如上所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID9。一种诊断试剂，其中，所述诊断试剂包括如上所述的人源单链抗体以及如上所述的DNA序列编码获得的融合蛋白中的一种或者多种。一种嵌合抗原受体的编码DNA分子，其中，所述嵌合抗原受体包括与c-Met特异性结合的单抗抗体、跨膜结构域以及胞内结构域；所述与c-Met特异性结合的单抗抗体为如上所述的人源单链抗体。所述的编码DNA分子，其中，所述嵌合抗原受体包括CD8跨膜结构域；所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列为SEQID14；所述嵌合抗原受体包括CD137分子结构域以及CD3ζ链结构域；所述CD137分子结构域的氨基酸序列为SEQID16；所述CD3ζ链结构域的氨基酸序列为SEQID18。一种特异性CAR-T细胞制剂的制备方法，其中，所述方法包括：体外构建如上所述的嵌合抗原受体的编码DNA分子；制备人外周白细胞；体外制备慢病毒载体；使用所述慢病毒载体将所述编码DNA分子转导至人T淋巴细胞；体外扩增转导后的CAR-T细胞。一种T细胞，其特征在于，所述T细胞应用如上所述的制备方法制备获得。有益效果：c-Met是较为保守的原癌基因，在许多肿瘤组织上以较高水平表达，如胃癌，肝癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌和卵巢癌等，是较好的肿瘤治疗靶点。以c-Met特异性结合的单链抗体为基础，可以制备出相应的单链抗体-Fc融合蛋白(用于肿瘤的诊断)，或者制备出嵌合抗原受体T细胞(用于肿瘤的治疗)。该肿瘤治疗和诊断方式具有显著的特异性，不会产生现有肿瘤治疗手段的问题，具有巨大的社会和经济效益。【附图说明】一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。图1为本专利技术实施例提供的蛋白表达载体的示意图；图2为本专利技术实施例提供的纯化蛋白的SDS-PAGE的电泳结果图；图3为本专利技术实施例提供的流式分选示意图；图4为本专利技术实施例提供的酵母表达的western-bolt结果示意图；图5为本专利技术实施例提供的亲和力检测结果示意图；图6为本专利技术实施例提供的真核表达载体的示意图；图7为本专利技术实施例提供的纯化融合蛋白的SDS-PAGE的电泳结果图图8为本专利技术实施例提供的ELISA反应的结果示意图；图9为本专利技术实施例提供的纯化融合蛋白的western结果示意图；图10为本专利技术实施例提供的流式分析的结果示意图；图11为本专利技术实施例提供的免疫荧光的结果示意图；图12为本专利技术实施例提供的细胞活性分析的结果示意图；图13为本专利技术实施例提供的死亡率分析的结果示意图；图14为本专利技术实施例提供的肿瘤生长曲线的结果示意图；图15为本专利技术实施例提供的慢病毒载体的示意图；图16为本专利技术实施例提供的CAR细胞表达的western验证实验示意图；图17为本专利技术实施例提供的体外实验效果的结果示意图；图18为本专利技术实施例提供的体内实验效果的结果示意图；图19为本专利技术实施例提供的ADCC实验的结果示意图。序列表中公开了SEQID1-SEQID18的18个氨基酸或者核苷酸序列：SEQID1为特异识别c-Met的人源单链抗体的重链可变区的核苷酸序列；SEQID2为特异识别c-Met的人源单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列；SEQID3为特异识别c-Met的人源单链抗体的重链可变区的核苷酸序列；SEQID4为特异识别c-Met的人源单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列。SEQID5为人c-Met单链抗体和人IgGFc融合蛋白的核苷酸序列；SEQID6为人c-Met单链抗体和人IgGFc融合蛋白的氨基酸序列；SEQID7为人c-Met单链抗体和鼠IgGFc融合蛋白的核苷酸序列；SEQID8为人c-Met单链抗体和鼠IgGFc融合蛋白的氨基酸序列；SEQID9为人c-Met单链抗体和兔IgGFc融合蛋白的核苷酸序列；SEQID10为人c-Met单链抗体和兔IgGFc融合蛋白的氨基酸序列；SEQID11为嵌合抗原受体的核苷酸序列；SEQID12为嵌合抗原受体的氨基酸序列；SEQID13为CD8跨膜结构域的核苷酸序列；SEQID14为CD8跨膜结构域的氨基酸序列；SEQID15为CD137分子结构域的核苷酸序列；SEQID16为CD137分子结构域的氨基酸序列；SEQID17为CD3ζ链结构域的核苷酸序列；SEQID18为CD3ζ链结构域的氨基酸序列。【具体实施方式】为了便于理解本专利技术，下面结合附图和具体实施例，对本专利技术进行更详细的说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源单链抗体，其特征在于，所述人源单链抗体用于特异性识别人c‑Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID 1；所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID 2。

【技术特征摘要】
1.一种人源单链抗体，其特征在于，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的核苷酸序列为SEQID1；所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQID2。2.一种人源单链抗体，其特征在于，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列为SEQID3；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQID4。3.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和人IgGFc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如权利要求1或2所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID5，所述DNA序列编码的氨基酸序列为SEQID6。4.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和鼠IgG2aFc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如权利要求1或2所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID7，所述DNA序列编码的氨基酸序列为SEQID8。5.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和兔IgGFc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如权利要求1或2所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID9，所述DNA序列编码的氨基酸序列为SEQID10。6.一种诊断...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永海，储年生，李正红，
申请(专利权)人：李永海，
类型：发明
国别省市：美国,US