本发明专利技术提供了用于增强聚合酶在高浓度（大于100 mM）盐下催化模板依赖性DNA合成中的持续性的方法和组合物。还公开了用于在存在0.8‑2.2微摩尔的核苷酸和35‑45°C的高温下，例如处于或接近聚合酶的解链温度，增强与活性DNA合成相容的聚合酶‑模板复合物的组装的方法和组合物。模板和聚合酶的复合物可以用于纳米孔测序。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纳米孔测序的聚合酶-模板复合物
本专利技术一般涉及用于改进DNA测序持续性、和更具体地经调节温度、核苷酸浓度和/或聚合酶浓度增强DNA测序反应中的测序产率的方法和组合物。背景纳米孔最近已出现作为用于询问核酸中序列和结构的无标记平台。数据通常被报告为离子电流的时间序列，因为当施加的电场施加在由电压钳位放大器控制的单个孔上时，确定DNA序列。可以在高带宽和空间分辨率下检查数百至数千个分子。纳米孔作为可靠的DNA分析工具成功的关键障碍是持续性或平均读取长度。例如，通过聚合酶有效结合模板是高测序产率的关键。通过修饰聚合酶以增加从模板依赖性测序反应获得的序列信息的量，可以增强这种和其他所需的特性。另外，还可以通过提供有利于形成（或稳定）聚合酶-模板复合物的条件来增加持续性。然而，由于可以运行测序反应的众多变化条件，优化某些测序反应例如基于纳米孔的测序的特定变量（条件），仍然在很大程度上难以实现。专利技术概述本文提供了可用于优化测序反应例如基于纳米孔的测序的方法和组合物。在某些实例方面，提供了利用高盐浓度来增强测序反应的方法和组合物。在一个方面，例如，提供了一种用于制备聚合酶-模板复合物的方法。该方法包括（a）提供聚合酶；和（b）使聚合酶与多核苷酸模板在含有高浓度盐并且基本上不含核苷酸的溶液中接触，从而制备聚合酶-模板复合物。在另一方面，提供了一种增加模板-聚合酶复合物的持续性的方法，该方法包括在包含高浓度盐并且基本上不含核苷酸的溶液中形成模板-聚合酶复合物；其中模板-聚合酶复合物的持续性大于在包含同等高浓度盐且存在核苷酸的溶液中形成时的相同模板-多核苷酸复合物的持续性。例如，通过模板与聚合酶的更快结合速率来增加持续性，和/或通过模板与聚合酶的较慢解离速率来增加持续性。在另一方面，提供了一种用于进行模板依赖性DNA合成的方法，该方法包括：（a）在包含高浓度盐并且基本上不含核苷酸的溶液中提供聚合酶-模板复合物；和（b）通过向溶液中加入核苷酸来启动模板依赖性DNA合成。在另一方面，提供了一种用于在高盐浓度下进行纳米孔测序的方法，该方法包括：（a）在包含高浓度盐的溶液中提供聚合酶-模板复合物，该溶液基本上不含核苷酸；（b）将聚合酶-模板复合物与纳米孔组合以形成纳米孔测序复合物；（c）向纳米孔测序复合物提供标记的核苷酸，以在高浓度盐下启动模板的模板依赖性纳米孔测序；和（d）当每种核苷酸与聚合酶结合时，借助纳米孔检测在每种核苷酸掺入期间与每种标记的核苷酸结合的标签，从而确定多核苷酸模板的序列。在各个前述方面的每一个中，聚合酶可以是变体聚合酶，例如包含与SEQIDNO：2的聚合酶具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的聚合酶。此外，纳米孔可以是单体纳米孔，例如OmpG纳米孔，或纳米孔可以是寡聚纳米孔，例如α-溶血素纳米孔。此外，高浓度盐定义为例如至少100mM的盐浓度。在另一方面，提供了储存或反应组合物，所述储存或反应组合物包含在至少100mM盐的溶液中的聚合酶-模板复合物。在一些实施方案中，组合物基本上不含核苷酸。在某些其他实例方面，提供了利用低核苷酸浓度和高温来增强测序反应的方法和组合物。例如，在一个方面，提供了一种制备聚合酶-模板复合物的方法。该方法包括，例如，提供聚合酶，然后使聚合酶与溶液中的多核苷酸模板接触，从而制备聚合酶-模板复合物。该溶液包含低浓度的核苷酸并具有高温。另一方面，提供了一种增加模板-聚合酶复合物的持续性的方法。该方法包括在溶液中形成聚合酶-模板复合物-该溶液包含低浓度的核苷酸并具有高温。在这些方法中，在高温溶液中形成的聚合酶-模板复合物的持续性大于在室温下由对照聚合酶-模板复合物溶液产生的持续性。在另一方面，提供了一种用于多核苷酸模板的基于纳米孔的测序的方法。该方法包括在溶液中形成聚合酶-模板复合物-该溶液包含具有高温的低浓度核苷酸。将形成的聚合酶-模板复合物与纳米孔组合以形成纳米孔-测序复合物。将标记的核苷酸提供给纳米孔测序复合物，以在高温下启动模板的模板依赖性纳米孔测序。借助于纳米孔，当每种标记的核苷酸与聚合酶结合时，在每种标记的核苷酸的掺入过程中检测与每种标记的核苷酸结合的标签，从而确定多核苷酸模板的序列。纳米孔可以是单体纳米孔，例如OmpG纳米孔，或多聚体纳米孔，例如基于α-溶血素的纳米孔。在涉及低核苷酸浓度和高温的前述方面的每一个中，该方法可以进一步包括用聚合酶-模板复合物的聚合酶使溶液饱和。例如，聚合酶可以是聚合酶变体，例如与SEQIDNO：2所示的氨基酸序列具有85％、90％、95％、98％或更多序列同一性的聚合酶。在某些方面，核苷酸的低浓度为0.8μM至2.2μM，例如1.2μM。在某些方面，高温高于室温，诸如35℃-45℃。在某些方面，高温为40℃。附图简述图1是由DNA聚合酶单核苷酸掺入所需的最小催化步骤的说明。该反应开始于游离DNA聚合酶（E）与双链引物/模板DNA复合物（DNAn）的结合，产生二元酶-DNA复合物（E·DNAn）。kon.DNA表示酶与模板的结合速率；和koff.DNA表示酶从酶-DNA复合物的解离速率。由kon.DNA和koff.DNA速率确定的平衡定义了聚合酶-模板复合物的静态持续性。因此，酶的静态持续性可以通过增加结合速率kon.DNA和/或降低解离速率koff.DNA的来增加。正确核苷酸（dNTP）在存在二价阳离子如Mg2+的情况下的结合，促进酶-DNA-dNTP三元复合物的形成（E•DNAn•dNTP•Mg2+）。kon，核苷酸表示酶的核苷酸结合速率。koff，核苷酸表示从酶模板复合物的核苷酸解离速率。当聚合酶延伸模板时，由kon，DNA和koff，DNA确定的平衡定义了聚合酶的复制持续性。因此，聚合酶的复制持续性可以通过DNA结合速率kon，DNA的增加和/或DNA解离速率koff，DNA的降低来增加。dNTP的结合诱导三元复合物中酶的第一次构象变化。在进入的dNTP的α-磷酸和模板/引物末端的3'-OH之间形成磷酸二酯键，以在引物末端产生添加的核苷酸碱基（E*·DNAn+1·PPi）。该反应产生焦磷酸盐（PPi）和质子。第二种构象变化允许PPi的释放以完成核苷酸掺入的循环。图2是显示在FRET置换测定中使用的示例性模板的图示。图3是显示在多磷酸盐核苷酸存在下形成聚合酶-模板复合物对模板与聚合酶在各种盐浓度下的结合速率的影响的示例性结果的图。参考实施例3。图4A-4C是显示图3中所示荧光信号的结合曲线的一系列图。参考实施例3。图5A-5B是一系列图，其显示了阻断的核苷酸对抑制聚合酶-模板复合物形成的影响的结果。在FRET测定中获得的荧光信号显示在（A）中，解离曲线显示在（B）中。参考实施例4.1。图6A-6B是显示核苷酸对聚合酶-模板复合物形成的影响和模板在Mg2+(♦)或20uMd6Ps（多磷酸核苷酸；■）存在下从形成的聚合酶-模板复合物的解离速率的示例性结果的一系列图。在FRET测定中获得的荧光信号显示在（A）中，解离曲线显示在（B）中。参考实施例4.2。图7A-7B是显示核苷酸（d6Ps）对聚合酶-模板复合物形成的影响和模板在不存在(♦)或存在（■）Ca2+的情况下从形成的聚合酶-模板复合物的解离速率的示例性结果的一系列图。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于制备聚合酶‑模板复合物的方法，其包括：（a）提供聚合酶；和（b）将所述聚合酶与多核苷酸模板在包含0.8 µM‑2.2 µM浓度的核苷酸且温度为35℃‑45℃的溶液中接触，由此制备聚合酶‑模板复合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.29 US 62/301607;2016.10.11 US 62/4064311.用于制备聚合酶-模板复合物的方法，其包括：（a）提供聚合酶；和（b）将所述聚合酶与多核苷酸模板在包含0.8µM-2.2µM浓度的核苷酸且温度为35℃-45℃的溶液中接触，由此制备聚合酶-模板复合物。2.权利要求1的方法，其还包括用所述聚合酶-模板复合物的聚合酶使溶液饱和。3.增加模板-聚合酶复合物的持续性的方法，所述方法包括在包含0.8μM至2.2μM浓度的核苷酸且温度为35℃-45℃的溶液中形成聚合酶-模板复合物，其中在高温溶液中形成的所述聚合酶-模板复合物的持续性大于在室温下由对照聚合酶-模板复合物溶液产生的持续性。4.权利要求3的方法，其中形成聚合酶-模板复合物包括用所述聚合酶-模板复合物的聚合酶使溶液饱和。5.权利要求1-4中任一项的方法，其还包括在形成聚合酶-模板复合物后提高溶液中核苷酸的浓度。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的聚合酶与如SEQIDID:14所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或更高的序列同一性或与其相同。7.基于纳米孔测序多核苷酸模板方法，所述方法包括：在包含浓度为0.8μM至2.2μM核苷酸的溶液中形成聚合酶-模板复合物，所述溶液具有高温；将形成的聚合酶-模板复合物与纳米孔组合以形成纳米孔测序复合物；向所述纳米孔测序复合物提供标记的核苷酸，以在35℃-45℃的高温下起始模板的模板依赖性纳米孔测序；借助于所述纳米孔，当每种标记的核苷酸与聚合酶结合时，在每种标记的核苷酸的掺入过程中检测与每种标记的核苷酸结合的标签，从而确定多核苷酸模板的序列。8.权利要求7的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：A阿耶，P萨瓦鲍曼，C施沃布，A比比洛，
申请(专利权)人：吉尼亚科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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