用于延长蛋白质半衰期的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过替换蛋白质一个或更多个氨基酸残基延长蛋白质或(多)肽半衰期的方法。进一步地，本发明专利技术关于通过上述方法制备的具有延长的半衰期的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于延长蛋白质半衰期的方法
本专利技术涉及一种通过替换蛋白质的与泛素化相关的一个或更多个赖氨酸残基来延长蛋白质或(多)肽半衰期的方法，且涉及具有延长的半衰期的蛋白质。
技术介绍
真核细胞中的蛋白质或(多)肽通过溶酶体系统和泛素-蛋白酶体系统两种不同途径被降解。分解10-20％的细胞蛋白的溶酶体系统，即没有底物特异性也没有精密时序可控性。也就是说，溶酶体系统是一种尤其分解大多数细胞外蛋白或膜蛋白的过程，例如表面蛋白通过内吞作用被细胞摄取，再被溶酶体降解。至于真核细胞中蛋白质的选择性降解，应涉及泛素-蛋白酶体途径(UPP)，在这之中，目标蛋白首先结合泛素结合酶以形成多聚泛素链，再被蛋白酶体识别并分解。大约80-90％的真核细胞蛋白是通过UPP降解的，因此，UPP被认为调控真核细胞内大部分蛋白的降解，且负责体内的蛋白质转换和体内稳态。泛素是一个由76个高度保守的氨基酸组成的小蛋白，且它存在于所有真核细胞中。在泛素的所有氨基酸残基中，第6、11、27、29、33、48和63位残基是赖氨酸(Lysine,Lys,K)，且已知第48位和63位的残基对多聚泛素链的形成起关键作用。通常称为E1、E2、E3的三种酶连续作用以促进泛素化，而被泛素标记的蛋白则被ATP依赖的蛋白质降解复合物中的26S蛋白酶体分解。如上所述，泛素蛋白酶体途径(UPP)由两个分离且连续的过程组成。一个过程是一定数目的泛素分子连接至底物蛋白的蛋白标记过程，而另外一个则是经标记的蛋白被26S蛋白酶体复合物降解的过程。泛素和底物蛋白之间的结合是通过泛素C末端的甘氨酸残基和底物的赖氨酸残基之间形成异肽键，然后再通过一系列酶(泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3)在泛素和底物蛋白之间形成硫脂键而实施的。已知E1(泛素激活酶)通过ATP依赖的反应机制激活泛素。被激活的泛素被转移至E2(泛素结合酶)的泛素结合域中的半胱氨酸残基上，然后E2运送被激活的的泛素到E3连接酶处或直接运送至底物蛋白处。E3同样催化底物蛋白的赖氨酸残基和泛素的甘氨酸残基之间形成异肽键。另外一个泛素能够被连接至与底物蛋白相连的泛素的C末端的赖氨酸残基上，额外的泛素部分的重复连接通过一定数目的泛素分子彼此相连而产生多聚泛素链。当多聚泛素链被生成之后，底物蛋白则被26S蛋白酶体选择性地识别并降解。与此同时，生物体内有着多种具有治疗效果的蛋白质。这些在体内具有治疗效果的蛋白质或(多)肽或生物活性多肽包括，但不限于，例如，生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素(干扰素-α或干扰素-β)、干扰素受体、集落刺激因子(CSF)、胰高血糖素样肽、白介素、白介素受体、酵素、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、G蛋白偶联受体、人生长激素(hGH)、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、G蛋白偶联受体、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白E、红细胞生成素、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、第七因子、第七因子a、第八因子、第九因子、第十三因子、纤维蛋白溶酶原激活因子、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、过氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板源生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降血钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、纤维蛋白结合肽、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子通道抑制剂、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、肠促胰酶肽、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。已知β-调理素促进分泌胰岛素的胰腺β细胞的增殖。因此，β-调理素能够以一年一次或两次施用于二型糖尿病患者，来维持胰腺β细胞的活性而控制血糖水平。施用β-调理素比施用胰岛素的副作用更小，这是因为被给予β-调理素治疗的患者能够为他们自己生产胰岛素。进一步地，已报道，在小鼠肝脏内β-调理素的暂时性表达促进胰腺β细胞增殖(Cell153,747758,2013)。生长激素(GH)，一种多肽荷尔蒙，在脑下垂体的前叶被合成和分泌，且它不仅与骨和软骨的生长有关，还与脂肪的分解和蛋白的合成的刺激这一新陈代谢相关。因此，生长激素能被用于治疗侏儒症，该侏儒症由多种身体情况(包括，例如，先天性心脏病、慢性肺病、慢性肾病或者慢性消耗性疾病；由生长激素缺乏、甲状腺功能减退或糖尿病引起的激素异常分泌；和诸如特纳综合征的先天遗传性疾病)引起。进一步地，已知生长激素调控STAT蛋白的转录(信号转导和转录激活因子)(Oncogene，19，2585-2597，2000)。已知胰岛素在人体内调节血糖的水平。因此，胰岛素能被用于治疗由于胰腺的胰岛细胞的功能被削弱而遭受血糖水平上升的一型糖尿病患者。另外，胰岛素能被用于虽然胰岛素仍然能正常地被分泌，但由于体细胞的胰岛素受体抵抗而不能控制血糖的二型糖尿病患者。根据之前的研究，有报道称胰岛素在肝脏内刺激STAT磷酸化，从而控制肝脏内的葡萄糖稳态(CellMetabolism3，267275，2006)。干扰素是通过免疫系统的细胞产生和分泌的一群天然产生的蛋白质，包括白细胞、自然杀伤细胞、纤维细胞和上皮细胞。干扰素被分为3类，例如一型、二型和三型，所谓的分类是按照被相应蛋白运送至的受体区分的。尽管干扰素的功能机制复杂还并没有被完全理解，但是已知它调节免疫系统对病毒、癌症和一些其他外部(或传染性)物质的应答。与此同时，已知干扰素不会直接杀死病毒或者肿瘤细胞，但是会促进免疫系统应答，并控制调节多种细胞的蛋白质的分泌的基因的功能，从而起到抑制肿瘤细胞生长的功能。至于一型干扰素，已知干扰素-α能被用于治疗乙肝和丙肝，干扰素-β可以被用于治疗多发性硬化。进一步地，相关研究报道干扰素-α可以增强STAT-1，STAT-2和STAT-3(JImmunol，187，2578-2585，2011)，以及它激活黑色素瘤细胞中的STAT3蛋白，有助于黑色素瘤的生成(EuroJCancer，45，1315-1323，2009)。进一步地，据报道，被干扰素-β处理过的细胞诱导包括AKT的信号通路的激活(Pharmaceuticals(Basel),3,994-1015,2010)。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，一种糖蛋白，其产生骨髓干细胞和粒细胞，且刺激骨髓分泌骨髓干细胞和粒细胞到血管中。G-CSF是一种集落刺激因子，并且也行使激素和细胞因子的功能。进一步地，C-CSF还通过增加神经可塑性和抑制细胞凋亡而作为一种神经营养因子，除此之外还对造血作用产生影响。G-CSF受体在脑和脊柱中的神经元中被表达。在中枢神经系统中，G-CSF诱导神经元的生成和增加神经可塑性，从而与细胞凋亡相关。因此，G-CSF被研究用于治疗神经元疾病，例如脑梗死。G-CSF可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种延长蛋白质或(多)肽半衰期的方法，所述方法包括用精氨酸替换所述蛋白质或(多)肽的一个或更多个赖氨酸残基，其中，所述赖氨酸残基与泛素C末端的甘氨酸相连。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.16 KR 10-2015-01607281.一种延长蛋白质或(多)肽半衰期的方法，所述方法包括用精氨酸替换所述蛋白质或(多)肽的一个或更多个赖氨酸残基，其中，所述赖氨酸残基与泛素C末端的甘氨酸相连。2.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为β-调理素。3.权利要求2所述的方法，其中，所述β-调理素具有如SEQNo.1所示的氨基酸序列，且对应于所述β-调理素的N末端第62、124、153和158位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。4.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为生长激素(GH)。5.权利要求4所述的方法，其中，所述生长激素具有如SEQNo.10所示的氨基酸序列，且对应于所述生长激素的N末端第64、67、96、141、166、171、184、194和198位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。6.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为胰岛素。7.权利要求6所述的方法，其中，所述胰岛素具有如SEQNo.17所示的氨基酸序列，且对应于所述胰岛素的N末端第53和88位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。8.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为干扰素-α。9.权利要求8所述的方法，其中，所述干扰素-α具有如SEQNo.22所示的氨基酸序列，且对应于所述干扰素-α的N末端第17、54、72、93、106、135、144、154、156、157和187位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。10.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为G-CSF。11.权利要求10所述的方法，其中，所述G-CSF具有如SEQNo.31所示的氨基酸序列，且对应于所述G-CSF的N末端第11、46、53、64和73位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。12.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为干扰素-β。13.权利要求12所述的方法，其中，所述干扰素-β具有如SEQNo.36所示的氨基酸序列，且对应于所述干扰素-β的N末端第4、40、54、66、73、120、126、129、136、144、155和157位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。14.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为红细胞生成素(EPO)。15.权利要求14所述的方法，其中，所述红细胞生成素(EPO)具有如SEQNo.43所示的氨基酸序列，且对应于所述红细胞生成素(EPO)的N末端第47、72、79、124、143、167、179和181位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。16.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为BMP2。17.权利要求16所述的方法，其中，所述BMP2具有如SEQNo.51所示的氨基酸序列，且对应于所述BMP2的N末端第32、64、127、178、185、236、241、272、278、281、285、287、290、293、297、355、358、379和383位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。18.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为FGF-1。19.权利要求18所述的方法，其中，所述FGF-1具有如SEQNo.59所示的氨基酸序列，且对应于所述FGF-1的N末端第15、24、25、27、72、115、116、120、127、128、133和143位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。20.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为瘦蛋白。21.权利要求20所述的方法，其中，所述瘦蛋白具有如SEQNo.64所示的氨基酸序列，且对应于所述瘦蛋白的N末端第26、32、36、54、56、74和115位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。22.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为VEGFA。23.权利要求22所述的方法，其中，所述VEGFA具有如SEQNo.73所示的氨基酸序列，且对应于所述VEGFA的N末端第22、42、74、110、127、133、134、141、142、147、149、152、154、157、169、180、184、191和206位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。24.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为胃饥饿素/肥胖抑制素前激素原(prepro-GHRL)。25.权利要求24所述的方法，其中，所述胃饥饿素/肥胖抑制素前激素原(prepro-GHRL)具有如SEQNo.78所示的氨基酸序列，且对应于所述G-CSF的N末端第39、42、43、47、85、100、111和117位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。26.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为食欲刺激激素(胃饥饿素)。27.权利要求26所述的方法，其中，所述食欲刺激激素(胃饥饿素)具有如SEQNo.80所示的氨基酸序列，且对应于所述食欲刺激激素(胃饥饿素)的N末端第39、42、43和47位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。28.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为GLP-1。29.权利要求28所述的方法，其中，所述GLP-1具有如SEQNo.89所示的氨基酸序列，且对应于所述GLP-1的N末端第117和125位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。30.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为IgG重链(HC)。31.权利要求30所述的方法，其中，所述IgG重链(HC)具有如SEQNo.94所示的氨基酸序列，且对应于所述IgG重链(HC)的N末端第49、62、84、95、143、155、169、227、232、235、236、240、244、268、270、296、310、312、339、342、344、348、356、360、362、382、392、414、431、436和461位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。32.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质为IgG轻链(LC)。33.权利要求32所述的方法，其中，所述IgG轻链(LC)具有如SEQNo.101所示的氨基酸序列，且对应于所述IgG轻链(LC)的N末端第61、64、67、125、129、148、167、171、191、205、212和229位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。34.一种具有延长的半衰期的蛋白质，其中，所述蛋白质的氨基酸序列的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换，且其中所述赖氨酸残基与泛素C末端的甘氨酸相连。35.权利要求34所述的具有延长的半衰期的蛋白质，其中，所述蛋白质为β-调理素、GLP-1、IgG重链、IgG轻链、食欲刺激激素(胃饥饿素)、G-CSF、VEGFA、瘦蛋白、FGF-1、BMP2、G蛋白偶联受体、人生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、食欲刺激激素前体、干扰素-α、干扰素-β、干扰素受体、集落刺激因子、胰高血糖素样肽、G蛋白偶联受体、白介素、白介素受体、酵素、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白E、红细胞生成素、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、第七因子、第七因子a、第八因子、第九因子、第十三因子、纤维蛋白溶酶原激活因子、纤维蛋白结合多肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、过氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板源生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降血钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子通道抑制剂、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛肽、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、肠促胰酶肽、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段。36.权利要求34所述的具有延长的半衰期的蛋白质，其中，所述蛋白质是具有如SEQNo.1所示氨基酸序列的β-调理素，且对应于所述β-调理素的N末端第62、124、153和158位的一个或更多个赖氨酸残基被精氨酸替换。37.权利要求34所述的具有延长的...

【专利技术属性】
技术研发人员：金敬坤，白光铉，裴成烈，金明宣，金贤美，柳艺恩，李兰，朴贞炫，金贞玉，
申请(专利权)人：UBI蛋白公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR