STORM/PALM显微成像方法及装置制造方法及图纸

一种STORM/PALM显微成像方法及装置，其中方法包括以下步骤：将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；产生激发光和活化光；将所述激发光和活化光合并形成照明光；用所述照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且所述成像物镜的前端置于所述折射率匹配液中。本发明专利技术将样品和成像透镜置于折射率匹配溶液中，可以有效控制样品深部的化学环境，为超高分辨成像提供了长时间稳定的光化学环境；另外以扫描光片方式照明厚样品，且以飞秒脉冲激光即行扫描双光子活化，减少了散射对照明、成像的影响，从而为厚样品的成像成为可能。

STORM/PALM microscopic imaging method and device

A STORM/PALM microscopic imaging method and apparatus comprising the following steps: placing a sample in a sample pool with a refractive index matching solution matched with the sample; generating excitation light and activation light; photosynthesis and formation of illumination light by the excitation light and activation; and irradiating the sample with the illumination light and completing the sample through an imaging objective. The front end of the imaging objective lens is placed in the refractive index matching liquid. By placing the sample and the imaging lens in a refractive index matching solution, the chemical environment in the deep part of the sample can be effectively controlled, providing a long-term stable photochemical environment for ultra-high resolution imaging; in addition, the thick sample is illuminated by a scanning light sheet, and the two-photon activation is scanned by a femtosecond pulse laser, thus reducing the scattering pairs. The influence of illumination and imaging is possible for imaging of thick samples.

【技术实现步骤摘要】
STORM/PALM显微成像方法及装置
本专利技术涉及一种光学成像方法及装置，尤其涉及一种适用于厚样品的STORM/PALM显微成像方法及装置。
技术介绍
近年专利技术的STORM/PALM超高分辨率光学显微技术，突破了传统光学成像的衍射分辨率极限，分辨率达到20～30nm甚至更低。然而，这种技术的应用还有很多限制。其中最主要的一点是，这种技术的观测深度有较大限制，其深度一般不超过几微米，因而只能应用于成像薄样品或样品表面。这一限制的原因首先在于，STORM/PALM的成像分辨率取决于单分子定位的精度，而为了高精度的单分子定位，必须高效的排除背景荧光以提高信噪比。为此，常规STORM的技术方案采取的是全内反射荧光(TIRF)或类似照明方式，这就造成了前述的观测深度限制。使用光片(LSM，或者SPIM)照明可以在厚样品内选择性的激发一个薄片区域，避免了大部背景的激发，可以有效的降低背景。Zanacchi等人提出了使用光片照明的方法，但是只实现了对一个细胞的组蛋白H2B的成像。未能对厚样品的成像提供解决方案。但使用光片照明进行厚样品的STORM/PALM成像仍存在一些问题。其中一个问题是样品散射对光片实际形状有一定的影响，常用的生物医学样品内部折射率不均匀，吸收不大但散射强烈，从而使得光片在厚样品内迅速失去片状照明的特性，且被激发的荧光也难以清晰成像。常规分辨率下厚样品成像的经验告诉我们，使用短脉冲激光双光子成像可能在一定程度上改善照明的弥散情况。Zanacchi等人概念性的提出以双光子光片照明作为活化光的方法，但未能真正展示厚样品STORM/PALM成像的可行性，且仅照明这一方面的改善，不能解决散射样品中单分子成像的问题。厚样品的STORM/PALM成像的另一个问题是很难形成样品深部的化学微环境，这是因为STORM成像需要一系列缓冲剂用于改善成像区域荧光染料的激发特性，而这些缓冲剂很难作用到厚样品内部，从而造成这一方法在厚样品中应用的障碍。
技术实现思路
基于以上问题，本专利技术提出一种用于STORM/PALM显微成像方法及装置，用于解决上述技术问题中的至少之一。为了实现上述目的，作为本专利技术的一个方面，本专利技术提出一种STORM/PALM显微成像方法，该方法包括以下步骤：步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；步骤S2、产生激发光和活化光；步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中。进一步地，上述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；该折射率匹配溶液的折射率包括1.35～1.50。进一步地，上述折射率匹配溶液还包含有添加剂，该添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。进一步地，上述活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。进一步地，上述飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。进一步地，在上述步骤S1之前，所述显微成像方法还包括对样品进行透明化处理。进一步地，上述激发光由连续激光器产生；该连续激光器的发射波长范围包括400nm～760nm。进一步地，上述激发光和活化光包括以扫描形式实现的贝塞尔光束或艾利光束。为了实现上述目的，作为本专利技术的另一个方面，本专利技术还提出一种STORM/PALM显微成像装置，包括载物系统和成像系统，其中：载物系统包括样品池，该样品池中放置有与样品相对应的折射率匹配溶液，该样品池具有至少两个开孔；成像系统包括照明光产生模块和成像模块，照明光产生模块用于将激发光和活化光合成照明光以照明样品，该成像模块包括成像物镜，成像物镜嵌于样品池的至少两个开孔的任一个，且其前端置于折射率匹配液中，以对样品进行成像。进一步地，上述载物系统还包括一位移台，用于对样品进行移动并将样品放置于样品池中。本专利技术提出的一种STORM/PALM显微成像方法及装置，具有以下有益效果：1、本专利技术将样品和成像透镜置于折射率匹配溶液中，可以有效控制样品深部的化学环境，为超高分辨成像提供了长时间稳定的光化学环境，从而为厚样品的超高分辨率成像提供必不可少的基础；2、本专利技术以扫描光片方式照明厚样品，且以飞秒脉冲激光即行扫描双光子活化，减少了散射对照明、成像的影响，从而为厚样品的成像成为可能；3、本专利技术以1mm为例的厚样品，可以获得优于100nm分辨率的成像。附图说明图1是本专利技术一实施例提出的用于厚样品的STORM/PALM显微成像方法原理图；图2是本专利技术一实施例提出的用于厚样品的STORM/PALM显微成像装置的三维结构示意图。图3是本专利技术一实施例提出的用于厚样品的STORM/PALM显微成像装置的成像结果示意图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术公开了一种STORM/PALM显微成像方法，包括以下步骤：步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；步骤S2、产生激发光和活化光；步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中。其中，在本专利技术的一些实施例中，上述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；该折射率匹配溶液的折射率包括1.35～1.50。在本专利技术的一些实施例中，上述折射率匹配溶液还包含有添加剂，该添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。在本专利技术的一些实施例中，样品在置于具有折射率匹配溶液的样品池中之前，优选地，应该对样品进行透明化处理，透明化处理后，将样品浸入折射率匹配溶液中使其均一化。在本专利技术的一些实施例中，活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。该飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。在本专利技术的一些实施例中，激发光由连续激光器产生，连续激光器的发射波长为400nm～760nm。例如，连续激光器的发射波长可以为405nm、488nm、561nm和647nm中的任一种。在本专利技术的一些实施例中，激发光和活化光是以扫描形式实现的贝塞尔光束或艾利光束，例如，激发光和活化光均为以扫描形式实现的贝塞尔光束。本专利技术还公开了一种STORM/PALM显微成像装置，包括载物系统和成像系统，其中：载物系统包括样品池，该样品池中放置有与样品相对应的折射率匹配溶液，该样品池具有至少两个开孔；成像系统包括照明光产生模块和成像模块，照明光产生模块用于将激发光和活化光合成照明光以照明样品，该成像模块包括成像物镜，成像物镜嵌于样品池的至少两个开孔的任一个，且其前端置于折射率匹配液中，以对样品进行成像。在本专利技术的一些实施例中，上述载物系统还包括一位移台，用于对样品进行移动并放置于样品池中。以下通过具体实施例对专利技术提出的一种STORM/PALM显微成像方法及装置进行详细描述。实施例1本实施例提出一种STORM/PALM显微成像方法，包括以下步骤：步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；步骤S2、产生激发光和活化光；步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；步骤S2、产生激发光和活化光；步骤S3、将所述激发光和活化光合并形成照明光；步骤S4、用所述照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且所述成像物镜的前端置于所述折射率匹配液中。

【技术特征摘要】
1.一种STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；步骤S2、产生激发光和活化光；步骤S3、将所述激发光和活化光合并形成照明光；步骤S4、用所述照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且所述成像物镜的前端置于所述折射率匹配液中。2.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；所述折射率匹配溶液的折射率为1.35～1.50。3.如权利要求2所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述折射率匹配溶液还包含有添加剂，所述添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。4.如权利要求1所述的STORM/PALM显微成像方法，其特征在于，所述活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。5.如权利要求4所述的STORM/PALM超高分辨显微成像方法，其特征在于，所述飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。6.如权利要求1所述的S...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕国强，王浩，祝清源，刘北明，杨倩如，徐程，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34