一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴制造技术

本发明专利技术公开了一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，包括一般内容物、表面和特征物；所述一般内容物分布于液滴内部，为聚合酶链反应提供反应条件；表面包裹于液滴外部，形成稳定的液滴界面；特征物位于液滴的内部，是生物反应相容的固体材料，在固体材料表面固载有模板分子链，该模板分子链可通过聚合酶链反应被放大信号，用于实现核酸分子的定性检测或者定量检测；本案中，每个微滴类似于单重PCR的一个管，每个微滴的扩增反应是相对独立的，能有效改善传统多重PCR反应体系较大而存在相互干扰的问题，是一种非常有效的多重核酸扩增方法。

A droplet for multiple polymerase chain reaction detection

The invention discloses a droplet used for multiplex polymerase chain reaction detection, including general contents, surfaces and characteristics; the general contents are distributed inside the droplet to provide reaction conditions for polymerase chain reaction; the surface is wrapped outside the droplet to form a stable droplet interface; and the characteristics are located inside the droplet. It is a biocompatible solid material with a template molecule chain immobilized on the surface of the solid material. The template molecule chain can be amplified by polymerase chain reaction for qualitative or quantitative detection of nucleic acid molecules. Relatively independent, can effectively improve the traditional multiplex PCR reaction system larger and the existence of mutual interference problems, is a very effective multiplex nucleic acid amplification method.

【技术实现步骤摘要】
一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴
本专利技术属于分子检测领域，具体涉及一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴。
技术介绍
聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)技术是目前应用最广泛的核酸检测技术，其主要优势在于简便、稳定，而且应用基础好。多重PCR的原理是在反应体系内同时加入多对特异性引物，同时扩增出多条目的DNA片段，由于各引物的扩增片段的大小存在明显差异，根据产物的片段大小或利用分子杂交以实现多个微生物的同时检测。自1988年首次提出多重PCR这个概念，经过多年的发展，多重PCR技术逐渐成熟。但PCR技术的主要局限在于多重基因检测可涵盖的靶基因数量有限，要实现多重检测往往需要多管来实现。虽然目前有些方法能够实现多重检测，但仍然存在一些问题。现有的多重检测技术都是先经过多重PCR扩增，这种多靶标的扩增有以下问题：特异性和灵敏度不理想；某一特定片段有限扩增；由于多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成引物二聚体的几率增大；如果非特异性产物优先扩增，将会大量消耗反应底物，降低特异性扩增效率。针对上述问题，许多学者开发了多种新型的多重PCR技术，如双启动寡核苷酸引物、多重连接依赖式探针扩增、特异性目标延伸、靶序列富集多重PCR、巢式PCR等，这些技术在某些方面使多重基因检测有一定的提高，但还是存在很多问题。目前对多重PCR的检测手段主要有毛细管电泳(或凝胶电泳)、液相芯片、质谱等方式，不管以何种方式检测，前期的多重扩增质量会直接影响检测结果。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，以降低多重PCR反应中多种探针的非特异性杂交反应，同时避免竞争反应所导致的底物不足问题。本案提供了一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，包括一般内容物、表面和特征物；其中，所述一般内容物分布于液滴内部，包括聚合酶链反应引物、脱氧核糖核苷三磷酸、酶、生物探针、金属离子，为聚合酶链反应提供反应条件；所述表面包裹于液滴外部，形成稳定的液滴界面，该表面可由同种或不同种特定成分形成，不易破裂，便于扩增、拾取、转移等后续操作；所述特征物位于液滴的内部，是生物反应相容的固体材料；所述固体材料表面固载有模板分子链；所述模板分子链通过聚合酶链反应被放大信号，用于定性检测或者定量检测。优选的是，所述的液滴，其特征在于，所述液滴的体积为常规聚合酶链反应反应体系的1/1000-1/10000000，典型液滴的体积为0.01纳升-100纳升。优选的是，所述特征物为编码微粒，每个液滴中最多含有一个编码微粒，每个编码微粒与单一种属的模板分子链偶联，形成映射关系；其中，所述模板分子因碱基序列不同为相异种属；所述每个编码微粒具有各自的编码特征。优选的是，所述液滴用于同一反应体系中多重聚合酶链反应的反应物检测，通过编码微粒的编码特征来确定模板分子链的种属；通过在模板分子链上发生的PCR反应使信号被放大而易于检测，并定性其为阳性(结合了目标模板分子链而发生了特异性PCR)或阴性(未结合目标模板分子链而没有发生特异性PCR反应)，以及通过分子探针的荧光等特性定量分析分子链的数量。优选的是，所述液滴用于多重数字聚合酶链反应体系，通过识别计数包含不同编码微粒的液滴，实现数字聚合酶链反应中的多重检测，即基于数字PCR原理，通过计数多个包含不同种固载模板分子链的编码微粒的微液滴，定量模板分子链在初始反应体系中有无或反演计算其含量。优选的是，所述编码微粒的编码方式包括光学编码、结构编码和物质种类编码。优选的是，所述光学编码采用荧光强度编码、荧光波长种类编码及光谱学特征编码组合编码。优选的是，所述结构编码采用微粒大小编码、多种微粒组合及位置顺序编码、微粒上的微图像结构编码。优选的是，所述物质种类编码采用微粒材料种类及质谱学特征编码。本专利技术的有益效果是：本专利技术将包含特征物的油水界面化微滴作为PCR反应器，每个微滴中包含一个特征物。包含特征物的PCR反应器因百万量级特征物的并行处理可高效实现反应器规模化。同时微滴中包含足量的DNA聚合酶及PCR反应所需原料，每个微滴相当于独立PCR反应体系，可有效降低多重PCR反应中多种探针的非特异性杂交反应，还可避免竞争反应导致底物不足的问题。每个特征物表面只有一种引物修饰，因此每个微滴中只含有针对特定的一对引物。由于每个微滴中只含有一对引物，在PCR过程中，不会产生引物非特异性扩增等问题；同时，每个微滴中有足够的底物和酶，不会发生竞争性扩增导致底物不足的问题。总结来讲，每个微滴类似于单重PCR的一个管，每个微滴的扩增反应是相对独立的。采用本专利技术的技术方案后，能有效改善传统多重PCR相互干扰的问题，是一种非常有效的多重核酸扩增方法。附图说明图1为采用本专利技术中的液滴进行核酸检测的技术流程图；具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。以下通过具体实施例进一步说明本专利技术。但实施例的具体细节仅用于解释本专利技术，不应理解为对本专利技术总的技术方案的限定。本实施例所提供的液滴用于数字化多重核酸检测方法，包括下述步骤：1)样本核酸提取：对待测生物样本进行预处理后，通过裂解、结合、洗涤和洗脱过程提取其中核酸；2)引物设计：根据不同待检的特定基因片段设计出各自的特异性引物；3)引物标记：将同一待检基因的特异性引物标记在同种编码微球上，得到分别被不同待检基因的引物标记的编码微球；4)杂交捕获：将步骤1)中提取的待测生物样本核酸与编码微球上的特异性引物进行变性杂交，使待测生物样本的DNA模板分子被特异性地结合在编码微球上，得到捕获DNA模板分子的编码微球，并建立起每个待测生物样本与编码微球的对应关系；5)微滴生成：将步骤4)中得到的编码微球和聚合酶链反应试剂均匀混合形成水相，利用微滴生成器生成大小一致的微滴；其中，每个微滴中最多含有一个步骤4)中得到的编码微球；6)扩增反应：在每个微滴中独立进行聚合酶链扩增反应，各微滴互不融合。反应产物；7)扫描检测：用分析仪器对编码微球进行逐个扫描，读取每个编码微球的信号。以编码微球为计数单元，基于数字PCR原理，实现待测生物样本中核酸的定量和多重检测。尽管本专利技术的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本专利技术的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本专利技术并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，其特征在于，包括一般内容物、表面和特征物；其中，所述一般内容物分布于液滴内部，包括聚合酶链反应引物、脱氧核糖核苷三磷酸、酶、生物探针、金属离子，为聚合酶链反应提供反应条件；所述表面包裹于液滴外部，形成稳定的液滴界面；所述特征物位于液滴的内部，是生物反应相容的固体材料；所述固体材料表面固载有模板分子链；所述模板分子链通过聚合酶链反应被放大信号，用于定性检测或者定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，其特征在于，包括一般内容物、表面和特征物；其中，所述一般内容物分布于液滴内部，包括聚合酶链反应引物、脱氧核糖核苷三磷酸、酶、生物探针、金属离子，为聚合酶链反应提供反应条件；所述表面包裹于液滴外部，形成稳定的液滴界面；所述特征物位于液滴的内部，是生物反应相容的固体材料；所述固体材料表面固载有模板分子链；所述模板分子链通过聚合酶链反应被放大信号，用于定性检测或者定量检测。2.根据权利要求1所述的液滴，其特征在于，所述液滴的体积为常规聚合酶链反应体系的1/1000-1/10000000，其中典型液滴的体积为0.01纳升-100纳升。3.根据权利要求1所述的液滴，其特征在于，所述特征物为编码微粒，每个液滴中最多含有一个编码微粒，每个编码微粒与单一种属的模板分子链偶联，形成映射关系；其中，所述模板分子因碱基序列不同为相异种属；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王策，白鹏利，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32