一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、鼠源性12S rRNA基因标准品、阴性对照品和阳性对照品。本发明专利技术通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量检测肉制品中鼠源性含量的目的，具有快速、灵敏、特异性好的特点，对判断肉制品中鼠源性含量具有重要意义。

A real-time fluorescence quantitative PCR kit for rat origin detection

The invention relates to a real-time fluorescent quantitative PCR kit for mouse-derived detection, which comprises a PCR reaction solution, an enzyme mixture, a mouse-derived 12S rRNA gene standard, a negative reference and a positive reference. The method can accurately and quantitatively detect rat-derived content in meat products by extracting DNA from the samples to be detected and combining with real-time fluorescence quantitative PCR detection technology. The method has the characteristics of fast, sensitive and good specificity, and is of great significance for judging rat-derived content in meat products.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及食品检测
，尤其涉及一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
近年来，食品中肉制品的安全问题日益突出，如国内的“假牛、假羊肉事件”、“假鸭血事件”等。其中羊肉中掺杂鼠肉成为羊肉造假的一种新手段，随着人们生活水平的提高及健康意识的增强，人们越来越关心食品的真伪性，食品中动物源性成分鉴别成为社会关注的焦点之一。过去用于肉制食品中物种的鉴别主要依赖于电泳法、免疫法、ELISA等蛋白质分析法。这些技术对于加工混合肉制品却无法分析出，而PCR技术基于其反应时间短，具有较高灵敏性、特异性成为鉴别加工食品中物种的优先选择。但传统的PCR技术在定量和大批量检测中局限性较大。因此，急于发现一种新的技术可以精确地辨别物种并实现快速、大容量的实时定量检测。实时荧光定量PCR凭借其高灵敏度和特异性，可检测熟肉以及混合样本等特点，已逐步成为肉类成分鉴别的主流技术。近年来，国内外已有利用TaqMan探针法对不同肉类种属进行鉴别的报告。动物的线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，对线粒体DNA的序列分析所提供的信息已广泛应用于研究物种之间和物种内部的系统进化分析、动物源性成分鉴定等领域。几乎所有家畜mtDNA的大小约在16.0~16.5kb之间。作为系统进化和种属特异性分析的对象，研究较多的线粒体DNA(mtDNA)基因有12SrRNA、18SrRNA基因、tRNA-Lys基因、ATP酶基因、细胞色素b（12SrRNA）基因等，D-loop区等。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、简便、灵敏、准确、可靠的用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。为解决上述问题，本专利技术所述的一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGGTGTAAAATCCCTTAAAC-3'；下游引物序列为5'-ATATAGGCTGAATTAGCAA-3'；探针序列为5’-ATAAATAAATAAATAGAA-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—鼠源性12SrRNA基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；其中12SrRNA基因标准品序列为5’-CGGCGTAAAACGTGTCAACTATAAATAAATAAATAGAATTAAAATCCAACTTATATGTGAAAATTCATTGTTAGGACCTAAACTCAATAACGAAAGTAATTCTAGTCATTTATAATACACGACAGCTAAGACCCAAACTGGGATTAGATACC-3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术采用基因克隆技术，将鼠源性DNA的12SrRNA基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有12SrRNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据鼠源性12SrRNA的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。2、本专利技术通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量检测肉制品中鼠源性含量的目的，对判断肉制品中鼠源性含量具有重要意义，必将在食品微生物检测领域发挥重要作用，3、本专利技术快速、灵敏、特异性好。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本专利技术引物和探针体系优化实验结果。a代表引物为1.6ul，探针为1.6ul；b代表引物为1.0ul，探针为1.6ul；c代表引物为1.0ul，探针为0.8ul；d代表引物为2.0ul，探针为0.8ul；e代表引物为1.6ul，探针为0.8ul；f代表引物为2.0ul，探针为1.0ul；g代表引物为1.0ul，探针为0.8ul；h代表引物为1.0ul，探针为1.0ul；i代表引物为2.0ul，探针为1.6ul。图2为本专利技术灵敏度实验结果。a代表质粒浓度分别为1.00×107copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照。图3为本专利技术特异性实验结果。其中出现标准扩增曲线的为鼠，未出现标准扩增曲线的为牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、兔、驴、蛙、狗、阴性对照。图4为本专利技术鼠源性标准曲线。具体实施方式一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGGTGTAAAATCCCTTAAAC-3'；下游引物序列为5'-ATATAGGCTGAATTAGCAA-3'；探针序列为5’-ATAAATAAATAAATAGAA-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—鼠源性12SrRNA基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；其中12SrRNA基因标准品序列为5’-CGGCGTAAAACGTGTCAACTATAAATAAATAAATAGAATTAAAATCCAACTTATATGTGAAAATTCATTGTTAGGACCTAAACTCAATAACGAAAGTAATTCTAGTCATTTATAATACACGACAGCTAAGACCCAAACTGGGATTAGATACC-3’（SEQIDNO.2）；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。其中：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mM Tris‑HCl、100mM KCl、0.12%Triton X‑100、0.12% 胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl2、50nM dNTP、500nM 上游引物、500nM 下游引物、300nM Taqman探针组成；其中上游引物序列为5'‑ CGGTGTAAAATCCCTTAAAC‑3'；下游引物序列为5'‑ATATAGGCTGAATTAGCAA‑3'；探针序列为5’‑ ATAAATAAATAAATAGAA‑3’；—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris‑HCl，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween®20和0.5% NP‑40组成；—鼠源性12S rRNA基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；其中12S rRNA基因标准品序列为5’‑CGGCGTAAAACGTGTCAACTATAAATAAATAAATAGAATTAAAATCCAACTTATATGTGAAAATTCATTGTTAGGACCTAAACTCAATAACGAAAGTAATTCTAGTCATTTATAATACACGACAGCTAAGACCCAAACTGGGATTAGATACC‑3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。...

【技术特征摘要】
2017.12.01 CN 20171125238841.一种用于鼠源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGGTGTAAAATCCCTTAAAC-3'；下游引物序列为5'-ATATAGGCTGAATTAGCAA-3'；探针序列为5’-ATAAATAAATAAATAGAA-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，陈游，沈颂东，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32