在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒。本发明专利技术首先公开了在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成。本发明专利技术进一步公开了包含上述引物对组的试剂盒。本发明专利技术在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒，该检测具有高敏感性和特异性，对肿瘤风险预测以及疗效评估具有重要的价值。

Primer pairs and kit for detecting epigenetic modifications of P53 gene in peripheral blood free DNA

The invention discloses a pair of primers and a kit for detecting the difference of P53 gene epigenetic modification in peripheral blood free DNA. The present invention first discloses a primer pair group for detecting differences in epigenetic modification of P53 gene in peripheral blood free DNA, which is composed of nucleotide sequences shown in sequence tables SEQ ID No.1 to SEQ ID No.10. The invention further discloses a kit containing the primer pairs. The primer pair and kit for detecting epigenetic modification differences of P53 gene in peripheral blood free DNA have high sensitivity and specificity, and have important value for tumor risk prediction and curative effect evaluation.

【技术实现步骤摘要】
在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒
本专利技术涉及生物
更具体地，涉及在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒。
技术介绍
在肿瘤预防与治疗的临床需求中，液体活检已成为肿瘤风险预测、靶向药物用药指导以及疗效评估的重要手段，其中肿瘤的早期风险评估是肿瘤预防的最重要的环节。血液因其含有大量肿瘤相关信息无疑是液体检测的最佳样本，其中外周血游离DNA是目前液体活检关注的热点，该游离DNA存在于血浆或血清中，它既可能来自于正常细胞死亡的释放物，也可能来自于肿瘤或癌前病变细胞的死亡释放物，同时无论正常细胞还是肿瘤细胞均可主动释放。肿瘤的发生发展过程中，不仅涉及基因结构的改变(突变、缺失、转位等)，而且更多的还表现在表观遗传学修饰的变化，尽管关键基因的结构改变在其过程中起着非常重要的作用，但结构性改变发生的位点与频率在很多肿瘤中差异很大，并具有随机性，同时这些改变在疾病的进程中是一个不断积累的过程，特别是在肿瘤的早期，来自于肿瘤结构性改变的DNA在外周血中的丰度都很低，对检测的敏感度要求很高，从而给检测带来了极大的挑战。尽管目前二代测序可以通过增加测序的深度来增加其敏感性，但一方面成本显著的增高，同时另一方面并不是基因所有结构性改变都与肿瘤有关，即有些突变并没有发现其与肿瘤的相关性。相对于基因突变的低丰度，基因的表观遗传学修饰变化则更为普遍，这样靶向基因修饰差异性的检测则具有更高的敏感性。表观遗传学研究发现，基因的修饰与其表达能力密切相关，这些修饰主要表现在DNA的甲基化和组蛋白的各种修饰上。近来研究发现，表观遗传学修饰既可发生在基因的启动子区域，也可发生在基因体(GeneBody，包含外显子、内含子以及两端的非翻译区)中。已知基因启动子的甲基化与基因表达呈负相关(影响转录因子以及RNA聚合酶的结合)，但对基因体中表观遗传学修饰的功能仍不清楚，当前的研究主要集中在对基因启动子区域的表观遗传学修饰上，而对基因体中各种表观遗传学修饰的变化则关注很少。由于肿瘤的发生的根本原因是基因组调控异常，P53基因已被证明在肿瘤的发生与发展过程中具有极其重要的作用，特别是在肿瘤的早期阶段，大量报道显示P53基因出现调控异常。因此，建立一种对P53基因表观遗传修饰差异的检测方法，将可实现对肿瘤的风险评估、疗效评价以及预后预测，对肿瘤预防以及治疗均具有重大的指导意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一组用于在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组。本专利技术的另一个目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、特异性强的在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：专利技术人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链，高温条件下定量PCR扩增的Ct值标记为CtHT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，低温条件下定量PCR扩增的Ct值标记为CtLT，△Ct＝|CtHT–CtLT|。在定量PCR扩增过程中，专利技术人发现在来自于正常人和肿瘤患者的外周血游离DNA中，P53外显子中的某些区域DNA片段，在低温变性条件下其扩增效率显著不同，而启动子区域则没有发现有显著性差异(结果没有给出)。即在低温变性条件下，相对于正常人，肿瘤患者的P53基因中的某些片段更难以解链，表现为扩增效率降低，这样针对P53基因的待测区域进行检测，可以鉴别外周血游离DNA的正常来源以及肿瘤来源。为进一步证明这种差异来自于表观遗传学修饰的不同，专利技术人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值显著小于正常人来源以及肿瘤来源的DNA样本，以上结果表明：无论正常人来源还是肿瘤来源的外周血游离DNA均存在不同程度的表观遗传学修饰，该修饰影响DNA的解链并进一步影响PCR的扩增效率，并且这种修饰在正常人与肿瘤患者中显著的不同。这样可根据正常人与肿瘤患者P53基因待测区域ΔCt值的不同，评估正常人与肿瘤患者该基因表观遗传学修饰的差异。研究发现，在正常人与肿瘤患者外周血来源的游离DNA中，单个区域修饰差异的变异较大，进一步对P53基因的不同区域进行了综合分析，其中不同区域xn的ΔCt标记为△Ctxn，并采用SPSS软件对不同区域的ΔCtxn值进行了加权计算，得到ΔCt加权值。专利技术人通过大量的筛选实验，获得了用于检测P53基因不同区域片段表观遗传学修饰差异的引物对组，得到了对应的△Ct值，对这些不同区域片段△Ct进行加权分析后，得到ΔCt加权值以及检测阈值(CutOff值)，并根据该阈值在肿瘤与正常样本中进行了敏感性与特异性分析。基于以上研究，本专利技术首先提供了一组在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列组成；其中，序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.3为扩增该区域片段的探针；SEQIDNo.4和SEQIDNo.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.7和SEQIDNo.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.10和SEQIDNo.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.9为扩增该区域片段的探针。进一步，本专利技术提供了一种在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，所述试剂盒包括由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列组成的引物对组。进一步，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品；所述质控对照DNA样品为裸露的DNA，例如可以为不存在表观遗传学修饰的PCR产物；为更好的模拟游离DNA的浓度，PCR产物需要高度稀释使其与样本浓度相当，再作为模板重新扩增；其中，所述质控对照DNA样品包括P53基因外显子3区域片段长度为140bp裸露DNA、P53基因外显子3区域片段长度为204bp裸露DNA、P53基因外显子4区域片段长度为153bp裸露DNA和P53基因外显子4区域片段长度为180bp裸露DNA。进一步，所述试剂盒还包括PCR反应液和ddH2O。本专利技术还提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：1)抽提外周血游离DNA；2)使用由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到P53基因待测区域片段xn的△Ctxn＝|Ctxn-HT–Ctxn-LT|及质控对照DNA样品xn'的△Ctxn'＝|Ctxn'-HT–Ctxn'-LT|；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组，其特征在于，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成；其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针。

【技术特征摘要】
1.一组在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组，其特征在于，该引物对组由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列组成；其中，序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.3为扩增该区域片段的探针；SEQIDNo.4和SEQIDNo.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.7和SEQIDNo.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.10和SEQIDNo.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.9为扩增该区域片段的探针。2.一种在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品，其中，所述质控对照DNA样品包括P53基因外显子3区域片段长度为140bp裸露DNA、P53基因外显子3区域片段长度为204bp裸露DNA、P53基因外显子4区域片段长度为153bp裸露DNA和P53基因外显子4区域片段长度为180bp裸露DNA。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液和ddH2O。5.一种如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：抽提外周血游离DNA；使用由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱运峰，石焕焕，操清兰，刘纯希，
申请(专利权)人：朱运峰，
类型：发明
国别省市：北京,11