一种磁珠法提取DNA的试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种磁珠提取DNA提取试剂盒，以及快速简介的提取多糖真菌DNA的方法。所述试剂盒包含溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液。本申请创新性的使用溶液Ⅱ对产菌核真菌的多糖物质进行剔除，使得在DNA提取过程中避免胞外多糖的干扰。试验过程中还创新性的对试剂盒所使用的磁珠进行了预处理，以DNA作为分子靶标，减少磁珠对RNA和蛋白质的吸附能力，该操作具有较高特异性的突出特点。该试剂盒适用于多糖类真菌的DNA提取，检测简单便捷，降低了胞外多糖对DNA提取的干扰。

A kit for extracting DNA from magnetic beads and its extraction method

The invention discloses a magnetic bead DNA extraction kit and a quick and brief method for extracting polysaccharide fungal DNA. The kit comprises solution I, solution II, solution III, solution IV, detergent, eluent and magnetic bead suspension. The application innovatively uses solution II to remove polysaccharides from Sclerotinia producing fungi so as to avoid the interference of extracellular polysaccharides during DNA extraction. During the experiment, the magnetic beads used in the kit were pretreated innovatively. DNA was used as a molecular target to reduce the ability of magnetic beads to adsorb RNA and protein. The operation has a high specificity. The kit is suitable for extracting DNA from polysaccharide fungi. The detection is simple and convenient, and the interference of exopolysaccharide on DNA extraction is reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种磁珠法提取DNA的试剂盒及提取方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法产菌核真菌DNA提取试剂盒，以及特异性强快速提取产菌核真菌DNA的方法。
技术介绍
菌核是由菌丝紧密连接交织而成的休眠体，其功能主要是抵御不良环境。常见的产菌核真菌有菌核属和丝核菌属真菌，该类真菌含有大量的胞外多糖。而真菌胞外多糖具有高吸附高粘稠特点，是困扰产菌核真菌分离提取高纯度DNA的难点之一。分子生物学手段目前已是真菌鉴定必不可少的技术之一，而DNA的分离纯化是进行分子生物学研究的基础。目前传统的CTAB法是提取的真菌DNA较常见的方法，其主要原理为CTAB是一种阳离子去污剂，可与蛋白质形成络合物，沉淀蛋白质物质，达到分离纯化核酸的目的，再经过酚、氯仿等物质的纯化离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对DNA的提取工作。但是针对多糖含量较高的产菌核真菌的DNA提取无法达到理想的效果。并且好使较长，使用溶剂对人体伤害较大。后来，柱式法真菌DNA提取试剂盒的发展大大提高了DNA提取的便利性。其主要原理为利用包埋有纯化填料的纯化柱对DNA分子的吸附作用，在提取过程中将DNA有效吸附在过滤膜中，再经离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对DNA的提取工作，操作速度加快，DNA浓度增加。当前，柱式法回收DNA应用广泛，但也有其自身缺陷，对于多糖物质含量较高的真菌在过滤网时常常会引起滤网的堵塞，使大量DNA片段无法吸附在过滤网上，最终导致DNA提取浓度低或者失败。近年来，因纳米磁性氧化铁的特殊性，磁珠法在真菌DNA提取应用中越来越受到关注。其原理为磁珠表面修饰有特殊化学基团或者依靠巨大的表面能，可在不同条件下对DNA分子形成特异性吸附和解吸附作用，吸附在磁珠内的DNA分子在外加磁场作用下可与磁珠分离，简单便捷的完成DNA的提取工作。虽然磁珠法大部分真菌DNA提取的操作简便，其不足之处也是无法排除多糖物质对DNA吸附的影响。另外，对于生物体的DNA提取，虽然具有很多经典的方法，但是，这些传统的方法不能日益满足一些测试的需要，有些测试需要纯度很高的DNA，而不希望含有任何其它杂质，例如蛋白、肽链、RNA、多糖或者其它非DNA的物质，因为这些物质会对测试产生干扰。有时候，尽管样本中具有DNA，但是仍然不能检测到目的DNA，这可能是含有的杂质对测试系统干扰造成的，虽然这些杂质含量很少，但是仍然会对检测结果造成干扰，有的时候，甚至让检测失败。这就需要对传统的方法进行改进，期望获得高纯度的DNA而不含有杂质。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种磁珠法产菌核真菌DNA提取试剂盒。该试剂盒可以有效除去样本溶液中的杂质而特异吸附DNA，使获得的DNA的纯度达到99.5％以上。特别的，对磁珠采用特殊试剂进行处理，可以让磁珠只特异吸附DNA，而不会吸附其它杂质，例如蛋白碎片、多肽、RNA或者其它杂质。这里所说的特异是可以吸附99.9％的DNA，而不会或者几乎很少吸附其它非DNA的物质，例如RNA，蛋白或者多肽，或者多糖。这种处理磁珠的试剂包括双甘膦溶液和异硫氰酸胍溶液，然后再用处理过的磁珠来吸附样本中的DNA，意外的发现DNA的纯度可以显著提高。双甘膦是属于常用的一种农药，他的处理，可能对磁珠的表面能增加，增强吸附能力，异硫氰酸胍是一种常用的蛋白变性试剂，这两种试剂对磁珠进行了处理，可以显著提高DNA的纯度，相对传统的常规提取DNA的纯度，具有显著的提高。在一些方式中，本专利技术提供一种磁珠法产菌核真菌DNA提取试剂盒，其特征在于包括：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；所述磁珠悬浮液：磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为1.2-2mm；所述溶液Ⅰ由葡萄糖，Tris-HCl和EDTA组成，pH值为8.0；所述溶液Ⅱ为无水乙醇和醋酸钾溶液；所述溶液Ⅲ为SDS溶液(氢氧化钠溶液稀释)；所述溶液Ⅳ包含盐酸胍和醋酸钾，pH值为3.5～4.5；所述洗涤液为乙醇溶液；所述洗脱液为去离子水；其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。作为优选的方案，所述的所双甘膦溶液的浓度为5mol/L，异硫氰酸胍溶液的浓度为8mol/L。另一方面，一种磁珠法产菌核真菌DNA提取的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，用液氮进行冷冻研磨；加入250μL溶液Ⅰ，再加入50μLRNaseA，充分混匀；步骤二：加入50μL蛋白酶K，充分混匀后60℃恒温水浴20min。12000rpm离心5min，取上清至新管中；步骤三：加入150μL溶液Ⅱ，轻轻上下翻动5-6次；12000rpm离心5min，取上清至新管中；步骤四：加入350μL溶液Ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。12000rpm离心5min，取上清至新管中；步骤五：加入350μL溶液Ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，室温静置2min；步骤六：加入50μL磁珠悬浮液，轻轻上下翻动后静置2min；步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用；所述溶液Ⅰ中葡萄糖浓度为50mmol/L，Tris-HCl浓度为25mmol/L，EDTA浓度为10mmol/L；所述溶液Ⅱ中醋酸钾溶液浓度为8mol/L；所述溶液Ⅲ中NaOH溶液浓度为0.2mol/L，SDS浓度为1-1.5％；所述溶液Ⅳ中盐酸胍浓度为3.0-4.5M，KAC浓度为0.75M。优选的，所述的所双甘膦溶液的浓度为5mol/L，异硫氰酸胍溶液的浓度为8mol/L。优选的，所述的双甘膦溶液与异硫氰酸胍溶液的体积比为1:1。优选的，其中，还包括对步骤七之后的对磁珠的洗涤和洗脱步骤：将含有已吸附DNA磁珠的离心管中加入500μL无水乙醇洗涤DNA，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有DNA的溶液至新管。在一些优选的方式中，对样本中颗粒较大的物质进行过滤去除，或者对一些含量高的物质，例如多糖，较大的蛋白物质进行初步去除，然后再加入处理过的磁珠进行吸附，发现该磁珠仅仅吸附样本中的DNA，而不会吸附样本中的其它物质，例如蛋白碎片、多肽、RNA或者其它杂质。沉淀多糖物质及吸附DNA，使产菌核真菌DNA浓度提高80％以上，可直接应用于测序、连接、PCR扩增等下游分子生物学实验。本专利技术的目的之二在于提供了一种磁珠法对产菌核真菌DNA快速提取的方法。配合由双甘膦溶液、异硫氰酸胍溶液和磁珠组成的磁珠悬浮液完成。该试剂盒可以提高磁珠对DNA分子的特异性吸附能力，使产菌核真菌DNA纯度提高90％以上。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种磁珠法产菌核真菌DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁珠法产菌核真菌DNA提取试剂盒，其特征在于包括：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；所述磁珠悬浮液：磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为1.2‑2mm；所述溶液Ⅰ由葡萄糖，Tris‑HCl和EDTA组成，pH值为8.0；所述溶液Ⅱ为无水乙醇和醋酸钾溶液；所述溶液Ⅲ为SDS溶液(氢氧化钠溶液稀释)；所述溶液Ⅳ包含盐酸胍和醋酸钾，pH值为3.5～4.5；所述洗涤液为乙醇溶液；所述洗脱液为去离子水；其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5‑10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5‑8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5‑6小时，PBS缓冲液冲洗5‑8次后备用。

【技术特征摘要】
1.一种磁珠法产菌核真菌DNA提取试剂盒，其特征在于包括：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；所述磁珠悬浮液：磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为1.2-2mm；所述溶液Ⅰ由葡萄糖，Tris-HCl和EDTA组成，pH值为8.0；所述溶液Ⅱ为无水乙醇和醋酸钾溶液；所述溶液Ⅲ为SDS溶液(氢氧化钠溶液稀释)；所述溶液Ⅳ包含盐酸胍和醋酸钾，pH值为3.5～4.5；所述洗涤液为乙醇溶液；所述洗脱液为去离子水；其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述的所双甘膦溶液的浓度为5mol/L，异硫氰酸胍溶液的浓度为8mol/L。3.一种磁珠法产菌核真菌DNA提取的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，用液氮进行冷冻研磨；加入250μL溶液Ⅰ，再加入50μLRNaseA，充分混匀；步骤二：加入50μL蛋白酶K，充分混匀后60℃恒温水浴20min。12000rpm离心5min，取上清至新管中；步骤三：加入150μL溶液Ⅱ，轻轻上下翻动5-6次；12000rpm离心5min，取上清至新管中；步骤四：加入350μL溶液Ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。12000rpm离心5min，取上清至新管中；步骤五：加入350μL溶液Ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，室温静置2min；步骤六：加入50μL磁珠悬浮液，轻轻上下翻动后静置2min；步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用；所述溶液Ⅰ中葡萄糖浓度为50mmol/L，Tris-HCl浓度为25mmol/L，EDTA浓度为10mmol/L；所述溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄宵，戴明雁，徐华莉，高颖，张明洲，
申请(专利权)人：浙江迪恩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33