一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法，包括以下步骤：预处理冻融、沉淀浓缩提清、碟式离心机连续离心、澄清过滤和超滤浓缩。由于采用了上述技术方案，本发明专利技术具有以下有益效果：本发明专利技术絮凝剂的使用，使重组禽流感病毒以沉淀提清这种温和的方法进行了初步的5‑10倍浓缩；避免使用管式离心机对病毒照成剪切力的损伤；沉淀阶段除去大量的杂蛋白，有效的提升了滤芯的通量降低；超滤阶段加入钝化剂，增加了超滤浓缩倍数，提升了病毒的纯度；工业化生产容易实现；通过血凝试验检测病毒浓缩液HA效力提升8倍‑10倍；通过灭活低温保存用于禽流感灭活疫苗的生产。

An industrial purification method for recombinant avian influenza virus

The invention discloses an industrial purification method for recombinant avian influenza virus, which comprises the following steps: freeze-thaw pretreatment, precipitation concentration and purification, continuous centrifugation by dish centrifuge, clarification and filtration and ultrafiltration concentration. By adopting the above technical scheme, the invention has the following beneficial effects: using the flocculant of the invention, the recombinant avian influenza virus is preliminarily concentrated 5_10 times in this mild method of precipitation and purification; avoiding the damage caused by the shearing force of the virus irradiated by a tubular centrifuge; removing a large number of impurity proteins in the precipitation stage; In the ultrafiltration stage, adding passivator can increase the concentration ratio of ultrafiltration and enhance the purity of virus; industrialized production is easy to achieve; detection of HA in virus concentrate by hemagglutination test can increase 8 times to 10 times; inactivated cryopreservation can be used in the production of inactivated avian influenza vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法
本专利技术涉及一种禽流感疫苗生产方法，具体说是一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法。
技术介绍
高致病性禽流感是一种禽类的烈性传染病，死亡率极高。在世界范围内流行，严重影响养禽业，流行期间其传播性极强，又可出现跨种间传播，感染人致死率非常高，成为人类健康和生命的严重威胁。许多国家和地区已经将高致病性禽流感作为头号监控对象，禽类发现疫情马上捕杀销毁。我国是畜牧业大国，而现如今家禽养殖的集约化程度的提高，家禽品种的多样化，家禽与禽产品流通的加快以及市场交易日益的频繁，禽流感的发生和流行变的越加的复杂，同时给养禽业带来了巨大的威胁，在养殖过程中，养殖户对于疫苗的需求迫切，疫苗生产的生产技术的更新换代越来越快，细胞悬浮培养禽流感工艺淘汰现有落后的生产工艺（鸡胚工艺）生产动物用流感疫苗已成为工艺趋势。而悬浮细胞工艺培养重组禽流感病毒生产疫苗，病毒的纯化工艺对产品的质量影响又是关键性因素。未经纯化的病毒液中含有大量的宿主细胞碎片等物质，含有大量杂蛋白的病毒液灭活后制苗会引起动物体强烈的应激反应，降低动物的生产性能如：产蛋率降低、体重增长变缓等。所以，疫苗在制造过程中杂蛋白的去除率越高产品质量越好。现有生产技术去除杂蛋白的方法是，病毒液收获后经过冻融，将病毒液经管式离心机，离心，1.0μm滤芯一级过滤，0.45μm滤芯二级过滤，加入甲醛灭活。利用现有工艺纯化的病毒液，经过管式离心机离心后由于离心机的构造机工作原理会对病毒本身产生一定的剪切力，从而破坏了病毒的结构，收率降低，影响免疫效果。由于管式离心机离心力小离心时间短，离心后浊度检测在300NTU以上。由于浊度较高澄清过程只能使用二级过滤，每根滤芯过滤100升左右就会在滤芯表面形成凝胶层而堵塞滤芯。工业化生产过程中就会消耗掉大量的滤芯，增加工艺耗材成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法，使用温和的方法预处理病毒液，避免使用管式离心机对病毒照成剪切力的损伤，沉淀阶段除去大量的杂蛋白，有效的提升了滤芯的通量降低，超滤阶段加入钝化剂，增加了超滤浓缩倍数，提升了病毒的纯度。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法，包括以下步骤一、预处理冻融：对收获检测合格的重组禽流感病毒细胞培养液进行低温-15℃冷库冷冻48小时后，2-8℃循环水池解冻，再次-15℃冷库冷冻48小时，2-8℃循环水池解冻两次冻融；二、沉淀浓缩提清：将经过二次冻融后的重组禽流感病毒细胞培养液导入沉淀提清罐，无菌加入6.6%病毒液絮凝剂A，10%絮凝剂B充分搅拌30分钟，0.1摩尔NaOH溶液调整混合液pH值至7.6，4℃沉淀罐中静止2小时沉淀，提取上清液；三、碟式离心机连续离心：将上清液经12000G的碟式离心机恒压连续离心，测试浊度达到40NTU即可进行澄清过滤；四、澄清过滤：将离心后重组禽流感病毒液导入澄清过滤器进行0.45μm膜过滤；五、超滤浓缩：将过滤后的重组禽流感病毒液与含1‰吐温-80的0.2MPBS，1:4混合30分钟，300KD中控纤维超滤浓缩10倍收获浓缩病毒液。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术絮凝剂的使用，使重组禽流感病毒以沉淀提清这种温和的方法进行了初步的5-10倍浓缩；2、避免使用管式离心机对病毒照成剪切力的损伤；3、沉淀阶段除去大量的杂蛋白，有效的提升了滤芯的通量降低；4、超滤阶段加入钝化剂，增加了超滤浓缩倍数，提升了病毒的纯度；5、工业化生产容易实现；6、通过血凝试验检测病毒浓缩液HA效力提升8倍-10倍；7、通过灭活低温保存用于禽流感灭活疫苗的生产。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步地说明。实施例1一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法，包括以下步骤一、预处理冻融：对收获检测合格的重组禽流感病毒细胞培养液进行低温-15℃冷库冷冻48小时后，2-8℃循环水池解冻，再次-15℃冷库冷冻48小时，2-8℃循环水池解冻两次冻融；二、沉淀浓缩提清：将经过二次冻融后的重组禽流感病毒细胞培养液导入沉淀提清罐，无菌加入6.6%病毒液絮凝剂A，10%絮凝剂B充分搅拌30分钟，0.1摩尔NaOH溶液调整混合液pH值至7.6，4℃沉淀罐中静止2小时沉淀，提取上清液；三、碟式离心机连续离心：将上清液经12000G的碟式离心机恒压连续离心，测试浊度达到40NTU即可进行澄清过滤；四、澄清过滤：将离心后重组禽流感病毒液导入澄清过滤器进行0.45μm膜过滤；五、超滤浓缩：将过滤后的重组禽流感病毒液与含1‰吐温-80的0.2MPBS，1:4混合30分钟，300KD中控纤维超滤浓缩10倍收获浓缩病毒液。本专利技术中用到的设备均为本领域的常用设备，在此不再赘述。以上所述仅为本专利技术示意性的具体实施方式，并非用以限定本专利技术的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本专利技术的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本专利技术保护的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法，其特征在于，包括以下步骤一、预处理冻融：对收获检测合格的重组禽流感病毒细胞培养液进行低温‑15℃冷库冷冻48小时后，2‑8℃循环水池解冻，再次‑15℃冷库冷冻48小时，2‑8℃循环水池解冻两次冻融；二、沉淀浓缩提清：将经过二次冻融后的重组禽流感病毒细胞培养液导入沉淀提清罐，无菌加入6.6 %病毒液絮凝剂A，10%絮凝剂B充分搅拌30分钟，0.1摩尔NaOH溶液调整混合液pH值至7.6，4℃沉淀罐中静止2小时沉淀，提取上清液；三、碟式离心机连续离心：将上清液经12000G的碟式离心机恒压连续离心，测试浊度达到40NTU即可进行澄清过滤；四、澄清过滤：将离心后重组禽流感病毒液导入澄清过滤器进行0.45μm膜过滤；五、超滤浓缩：将过滤后的重组禽流感病毒液与含1‰吐温‑80的0.2MPBS，1:4混合30分钟，300KD中控纤维超滤浓缩10倍收获浓缩病毒液。

【技术特征摘要】
1.一种重组禽流感病毒的工业化纯化方法，其特征在于，包括以下步骤一、预处理冻融：对收获检测合格的重组禽流感病毒细胞培养液进行低温-15℃冷库冷冻48小时后，2-8℃循环水池解冻，再次-15℃冷库冷冻48小时，2-8℃循环水池解冻两次冻融；二、沉淀浓缩提清：将经过二次冻融后的重组禽流感病毒细胞培养液导入沉淀提清罐，无菌加入6.6%病毒液絮凝剂A，10%絮凝剂B充分搅拌30分钟，0.1摩尔NaOH溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝阳，毛娅卿，王嘉，王富猛，王茂勇，吕日红，宋桂才，
申请(专利权)人：山东信得动物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37