一种L-苹果酸钠的直接酶促转化生产方法技术

本发明专利技术公开了直接酶促转化生产L‑苹果酸钠的方法，该方法包括：以富马酸和钙盐为原料，在延胡索酸水合酶的催化下生产L‑苹果酸钙，然后经碳酸钠中和后，制备得到L‑苹果酸钠。本发明专利技术通过选择性地克隆表达催化正向反应的延胡索酸水合酶的编码基因片段，使上述反应平衡向L‑苹果酸盐合成的方向偏移，同时采用钙型底物进行催化，解决了底物残留导致的产品质量问题，同时，作为副产物生成的碳酸钙回收利用使得整个生产过程中无副产物排放，实现了原子的经济性转化，具有显著的工业应用价值和环境效益。

【技术实现步骤摘要】
一种L-苹果酸钠的直接酶促转化生产方法
本专利技术涉及一种L-苹果酸钠的酶促转化生产方法，属于生物催化制备有机酸及其盐的领域。
技术介绍
L-苹果酸钠是DL-苹果酸钠的一种光学异构体，与DL-苹果酸钠相比，L-苹果酸钠可直接进入三羧酸循环参与人体的新陈代谢，具有重要的生理活性功能。在DL-苹果酸钠中，其含有的D-苹果酸钠是不具有生理活性的，需经过肝脏的消旋酶和肾脏的氧化还原酶作用，才可被机体利用，鉴于此，DL-苹果酸钠已被禁止在老年人、肝肾功能障碍患者及婴幼儿食品中使用，从而避免D-苹果酸钠在人体内的残留并由此减轻人体的代谢负担。因此，生产单一旋光性的L-苹果酸钠已是必然趋势。然而，与DL-苹果酸钠的生产成本相比，目前商业化的L-苹果酸钠生产技术是通过将L-苹果酸和碳酸钠等进行中和反应来制备L-苹果酸钠，此过程存在如下缺点：(1)在此过程中生成大量的作为副产物的硫酸钙，在酸解时消耗大量的硫酸，并且碳酸钙的消耗量也较高；(2)采用L-苹果酸进行中和反应来制备L-苹果酸钠时，由于作为原料的L-苹果酸的价格较高，因此造成L-苹果酸钠的生产成本较高，从而制约了L-苹果酸钠的广泛应用；(3)当上述过程中涵盖L-苹果酸的生产步骤时，由于该步骤涉及浓缩、结晶、干燥等环节，整体能耗较高。随着生物催化技术的发展，采用酶促转化工艺直接生产L-苹果酸钠已然成为未来的发展方向。就目前的报道而言，涉及L-苹果酸钠酶促转化工艺的现有技术(例如，中国专利申请CN200610161572.3；胡永红等，反应分离耦合技术生产L-苹果酸工艺过程的优化研究，《生物工程学报》，17卷5期，2001年9月)关注较多的是采用延胡索酸酶将底物富马酸(也称为延胡索酸)或其盐转化为L-苹果酸的研究。其中，需要对反应中的作为中间产物生成的L-苹果酸盐(例如L-苹果酸钙)利用硫酸等强酸进行处理以得到产物L-苹果酸。由于上述处理，使得通过L-苹果酸的中和反应进一步生产L-苹果酸钠的成本较高。另外，部分现有技术中提到了将底物富马酸制成富马酸钠并通过延胡索酸酶的水合作用可生成苹果酸钠，但是由于该反应是可逆的，富马酸钠的平均转化率低(≤70％)，目的产品(即，L-苹果酸钠)的浓度低，导致了终产物中的富马酸钠的含量过高，增加了后续的分离成本，而且对L-苹果酸钠的品质具有较大的不利影响(而高品质的L-苹果酸钠才是食品行业所需要的)。因此，在本领域中，目前仍需要对L-苹果酸钠的酶促转化工艺进行改进以降低生产成本(例如，不再采用L-苹果酸作为反应原料)并提高产物的品质。基于本领域的现有技术存在的上述问题，在生产L-苹果酸钠时采用何种酶促转化方法来同时满足低生产成本和高产物品质的要求成为本专利技术关注的重点。
技术实现思路
本专利技术人通过深入的研究发现，当采用富马酸和特定的钙盐作为原料时，中间产物L-苹果酸钙的沉淀有助于促进酶促反应向生成L-苹果酸钙这一中间产物的方向进行，从而提高了反应效率。而且，通过使L-苹果酸钙与碳酸钠直接反应，不仅省略了生产得到L-苹果酸的这一中间处理步骤，而且通过生成L-苹果酸钠溶液和作为沉淀物的碳酸钙，从而可容易地将副产物碳酸钙与本专利技术的期望产物L-苹果酸钠分离，并由此得到高品质的期望产物L-苹果酸钠，且作为副产物的碳酸钙可随后循环利用，藉此进一步降低了生产成本。此外，在通过酶促转化来生产L-苹果酸钠的工艺中，考虑到用于催化反应的酶的活性也会进一步影响反应的进行方向，并由此影响期望产物(即，L-苹果酸钠)的收率和品质。因此，如果采用能够有利于酶促反应向生成中间产物L-苹果酸钙的方向进行的延胡索酸水合酶，将会进一步降低生产成本并进一步提高期望产物的收率和品质。已知延胡索酸水合酶是广泛存在于生物体内的一种组成酶，是三羧酸循环的关键酶之一，既可催化富马酸盐生成L-苹果酸盐，又可将L-苹果酸盐脱水生成富马酸盐，是一种能够催化可逆反应的酶。延胡索酸水合酶主要包括fumaraseA(简称FUMA)、fumaraseB(简称FUMB)和fumaraseC(简称FUMC)这三种类型的酶，分别通过fumA、fumB和fumC三种基因编码，其中FUMA和FUMC倾向于催化富马酸盐水合生成L-苹果酸盐，FUMB则倾向于逆方向的催化。由于天然的表达延胡索酸水合酶的菌株中通常同时存在上述三种基因，因此，从上述菌株分离得到的天然的延胡索酸水合酶在用于生产L-苹果酸盐时表现出可逆催化的性质，虽然反应平衡偏向于L-苹果酸盐合成的方向，但是经常存在酶促反应不完全而导致的终产品的品质不高的问题。为了克服酶促转化反应不完全导致的产品品质等问题，本专利技术可以采用通过如下方法制备得到的延胡索酸水合酶：对天然菌株(例如，黄色短杆菌，Brevibacteriumflavum)中的特定的延胡索酸水合酶的编码基因进行选择性地克隆并对得到的基因序列根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，即，将fumA和/或fumC基因克隆并进行密码子优化，随后与表达载体可操作地连接，并导入宿主细胞(优选大肠杆菌)中进行表达，由此得到FMUA和/或FMUC这两种酶。将FMUA和/或FMUC这两种酶用于酶促转化反应中，能够使酶促转化反应倾向于向L-苹果酸盐合成的方向进行。本专利技术的目的在于提供一种通过酶促转化直接生产L-苹果酸钠的方法，该方法包括以下步骤：(1)将富马酸和选自碳酸氢钙、氢氧化钙和碳酸钙中的一种或多种钙盐加入水中并搅拌混匀以进行中和反应，待该中和反应完成后，任选调节反应体系的pH值为6.5-7.0，得到富马酸钙悬浊液；(2)向步骤(1)得到的所述富马酸钙悬浊液中加入延胡索酸水合酶催化制剂进行酶促反应，生成L-苹果酸钙悬浊液，其中，所述延胡索酸水合酶催化制剂选自延胡索酸水合酶或者表达所述延胡索酸水合酶的重组工程菌，所述延胡索酸水合酶为FUMA、FUMC或它们的混合物；(3)向步骤(2)得到的所述L-苹果酸钙悬浊液中加入碳酸钠以进行中和反应，待该中和反应完成后，得到L-苹果酸钠和碳酸钙的混合物；(4)将步骤(3)得到的所述混合物进行固液分离，得到L-苹果酸钠的上清液以及作为沉淀物的碳酸钙，其中，将所述L-苹果酸钠的上清液进行处理制得固体的L-苹果酸钠，将所述碳酸钙回收以在步骤(1)中作为钙盐循环使用。有益效果相比于传统的通过L-苹果酸中和反应制备L-苹果酸钠的工艺和现有技术的富马酸钠酶促转化工艺，本专利技术所述的方法具有如下优点：(1)本专利技术所述的方法中采用的延胡索酸水合酶FUMA和FUMC大大降低了逆反应程度；(2)在反应过程中，作为产物的碳酸钙在回收后能够循环使用，降低了原料成本；(3)由于目标产物(L-苹果酸钠)和副产物(碳酸钙)二者在水溶液中的溶解度差异，容易将二者分离，无需复杂操作，有利于显著降低生产成本；(4)无需制备作为中间产物的L-苹果酸，降低了能耗和生产成本；(5)采用本专利技术所述的方法制备得到的反应产物中的富马酸/富马酸盐的含量非常低(通常小于等于1wt％)，因此，无需进行分离。(6)实现了L-苹果酸钠的原子经济性，达到了“零排放”的理想目标。综上所述，本专利技术具有显著的工业应用价值和环境效益。附图说明图1示出了在本专利技术的一个实施方式中以富马酸和碳酸钙为原料转化制备L-苹果酸钠的工艺流程及其所涉及的主本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过酶促转化直接生产L‑苹果酸钠的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将富马酸和选自碳酸氢钙、氢氧化钙和碳酸钙中的一种或多种钙盐加入水中并搅拌混匀以进行中和反应，待所述中和反应完成后，任选调节反应体系的pH值为6.5‑7.0，得到富马酸钙悬浊液；(2)向步骤(1)得到的所述富马酸钙悬浊液中加入延胡索酸水合酶催化制剂进行酶促反应，生成L‑苹果酸钙悬浊液，其中，所述延胡索酸水合酶催化制剂选自延胡索酸水合酶或者表达所述延胡索酸水合酶的重组工程菌，所述延胡索酸水合酶为FUMA、FUMC或它们的混合物；(3)向步骤(2)得到的所述L‑苹果酸钙悬浊液中加入碳酸钠以进行中和反应，待所述中和反应完成后，得到L‑苹果酸钠和碳酸钙的混合物；(4)将步骤(3)得到的所述混合物进行固液分离，得到L‑苹果酸钠的上清液以及作为沉淀物的碳酸钙，其中，将所述L‑苹果酸钠的上清液进行处理制得固体的L‑苹果酸钠，将所述碳酸钙回收以在步骤(1)中作为钙盐循环使用。

【技术特征摘要】
1.一种通过酶促转化直接生产L-苹果酸钠的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将富马酸和选自碳酸氢钙、氢氧化钙和碳酸钙中的一种或多种钙盐加入水中并搅拌混匀以进行中和反应，待所述中和反应完成后，任选调节反应体系的pH值为6.5-7.0，得到富马酸钙悬浊液；(2)向步骤(1)得到的所述富马酸钙悬浊液中加入延胡索酸水合酶催化制剂进行酶促反应，生成L-苹果酸钙悬浊液，其中，所述延胡索酸水合酶催化制剂选自延胡索酸水合酶或者表达所述延胡索酸水合酶的重组工程菌，所述延胡索酸水合酶为FUMA、FUMC或它们的混合物；(3)向步骤(2)得到的所述L-苹果酸钙悬浊液中加入碳酸钠以进行中和反应，待所述中和反应完成后，得到L-苹果酸钠和碳酸钙的混合物；(4)将步骤(3)得到的所述混合物进行固液分离，得到L-苹果酸钠的上清液以及作为沉淀物的碳酸钙，其中，将所述L-苹果酸钠的上清液进行处理制得固体的L-苹果酸钠，将所述碳酸钙回收以在步骤(1)中作为钙盐循环使用。2.如权利要求1所述的方法，在所述步骤(1)中，所述富马酸与所述钙盐的摩尔比为1:1至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周铁成，王云山，王自强，冯晓东，赵晶，
申请(专利权)人：怀来县长城生物化学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13