一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法技术

本发明专利技术属于病原微生物免疫学检测技术领域，涉及一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明专利技术分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb鼠源单克隆抗体细胞株是以纯化的2型猪链球菌05ZYH33的表面蛋白Lmb为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠，当小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，用ELISA法筛选出分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明专利技术的抗体效价很高，具有很好的特异性。

【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法
本专利技术属于病原微生物免疫学检测
，涉及一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
技术介绍
猪链球菌(Streptococcussuis，S.suis)是一种重要的人畜共患病的病原菌，可感染猪或人引起急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等多种临床疾病，给养猪业带来巨大损失，同时对公共卫生事业造成严重威胁。根据荚膜多糖的抗原性，S.suis可分为33个血清型，其中1、2、1/2、7、9、14型具有致病性，以S.Suis2致病性最强。我国于1998年和2005年分别在江苏和四川相继暴发的S.suis疫情，导致了严重的公共卫生事件，引起世界范围内对S.suis感染的关注。目前已有报道S.suis2多重耐药性菌株的出现，使得S.suis2的预防和控制面临严峻的挑战，筛选致病性相关的表面蛋白和快速准确的检测鉴定该菌感染方法的研究成为当今研究的热点。早期有关S.suis2保护性抗原分子和分子检测手段的研究主要集中于毒力因子。之前发现的毒力因子主要包括荚膜多糖(capsularpolysaccharide，CPS)、溶菌酶释放蛋白(muramidasereleasedprotein，MRP)、胞外因子(extracellularfactor，EF)、溶血素(suilysin，SLY)等，但是研究发现相当数量的S.suis2致病株并不含以上毒力因子，使它们作为疫苗的使用受到限制。因此，开展S.suis2新发现的毒力相关表面蛋白组分的免疫原性研究，为今后发展安全有效的新型疫苗具有重要意义。目前，杂交瘤单克隆抗体的应用范围愈来愈广泛，已经深入到整个生物医学的各个领域，诸如生物化学、分子生物学、免疫学、药理学、病毒学、细菌学、寄生虫学、肿瘤学、遗传学、药物学、血液病学、内分泌学等等。其实，抗体不仅仅用于医学和生物学,它的应用范围已扩大到农业、工业、基础研究、环境保护和食品检测等各个方面。特别是近几年来,抗体在动植物疾病的防治方面越来越活跃。单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势，单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原抗体反应的特异性，减少了与其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可行度更大。Lmb蛋白(Lamininbindingprotein)是一个在猪链球菌中鉴定的表面蛋白，Lmb蛋白免疫原性强且广泛存在于猪链球菌多数血清型中，课题组前期工作也证实了Lmb是一个很好的诊断抗原。Lmb单克隆抗体的成功专利技术为猪链球菌快速、准确的诊断奠定了坚实的实验基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了建立快速、可靠的2型猪链球菌检测方法，提供一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术的另一目的是提供该杂交瘤细胞的制备方法。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一株抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株通过如下方法制备：(1)采用纯化的2型猪链球菌05ZYH33的表面蛋白Lmb四次免疫雌性Balb/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；(3)以纯化后的重组Lmb蛋白为抗原包被ELISA板，使用间接ELISA法筛选阳性克隆；再进一步以重组Lmb蛋白为抗原,釆用Westernblot法再次验证筛选得到的阳性克隆；最后通过染色体计数证明筛选得到的阳性克隆，最终获得杂交瘤细胞株2E3。其中，步骤(1)特征在于：选用雌性6周Balb/c小鼠，采用完全弗氏佐剂乳化的重组Lmb蛋白为免疫原，注射蛋白量为100μg/只鼠；间隔2周追加免疫共3次，并改为不完全弗氏佐剂乳化，注射蛋白量保持不变；在融合前3天加强免疫一次，注射蛋白量为100μg/只鼠。一种制备分泌抗猪链球菌2型表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包含如下步骤：(1)采用弗氏佐剂等体积乳化2型猪链球菌表面蛋白Lmb四次免疫雌性Balb/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；(3)以纯化后的重组Lmb蛋白为抗原包被ELISA板，以重组Lmb蛋白为包被抗原采用间接ELISA法筛选阳性克隆；进一步以重组蛋白Lmb为抗原用Westernblot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆；最后通过染色体计数证明筛选得到的阳性克隆，最终获得分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb的杂交瘤细胞株2E3。其中，步骤(1)特征在于：选用雌性6周Balb/c小鼠，采用完全弗氏佐剂乳化的重组Lmb蛋白为免疫原，注射蛋白量为100μg/只鼠；间隔2周追加免疫共3次，并改为不完全弗氏佐剂乳化，注射蛋白量保持不变；在融合前3天加强免疫一次，注射蛋白量为100μg/只鼠。有益效果1.本专利技术采用细胞融合技术，取重组Lmb蛋白免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，经ELISA、WesternBlot、染色体数目鉴定，成功获得一株分泌抗猪链球菌2型表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E3。2.本专利技术获得的杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔，获得腹水抗体，纯化腹水后得到单克隆抗体，经鉴定单克隆抗体亚型为IgG1型，用间接ELISA检测抗体效价为1∶819200，抗体效价高。3.本专利技术制备的单克隆抗体与猪链球菌共孵育，明显影响猪链球菌的生长速度，通过革兰氏染色技术发现该抗体明显影响猪链球菌的成链情况；猪链球菌2型表面蛋白Lmb具有较好的免疫原性、高度的保守性和基因分布广泛性。本专利技术为疫苗的研制奠定了基础。4.本专利技术的抗猪链球菌2型表面蛋白Lmb特异性单克隆抗体具有很好的特异性，对猪链球菌具有识别作用，可以作为鉴定该病原的有力工具，为人感染猪链球菌的快速诊断、流行病学检测和防控奠定实验基础。附图说明图1Lmb单克隆抗体效价检测结果.图2Lmb单克隆抗体与重组Lmb蛋白的WesternBlot结果图3Lmb单克隆抗体纯化结果具体实施方案实施例1：免疫和细胞融合、筛选及克隆化1.选用6周龄雌性BALB/c小鼠。采用完全弗氏佐剂乳化的重组Lmb蛋白为免疫原，注射蛋白量为100μg/只鼠；间隔2周追加免疫共3次，并改为不完全弗氏佐剂乳化，注射蛋白量保持不变；在融合前3天加强免疫一次，注射蛋白量为100μg/只鼠。2.细胞融合、筛选及克隆化小鼠加强免疫3天后无菌取脾脏细胞(2×108)和SP2/0细胞(4×107)，再加入预热的50％PEG进行融合，融合细胞悬浮于HAT培养基中，分布于含饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养，每3-4天半量换HAT培养基，7天后改用HT培养基，14天后改用完全1640培养基。用重组Lmb蛋白包被，取杂交瘤细胞培养上清做ELISA进行抗体检测，阳性克隆通过有限稀释法进行3-4次克隆化。实施例2：间接ELASA方法检测抗体每孔加入100μl5μg/ml的重组Lmb蛋白，4℃过夜包被，PBST洗板三次，加入200μl封闭液(3％BSA)37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗板三次，加入100μl杂交瘤细胞培养上清，37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F1，其特征在于该杂交瘤细胞株通过如下方法制备：(1)采用纯化的2型猪链球菌05ZYH33的表面蛋白Lmb四次免疫雌性Balb/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；(3)以纯化后的重组Lmb蛋白为抗原包被ELISA板，使用间接ELISA法筛选阳性克隆；再进一步以重组Sao蛋白为抗原,釆用Western blot法再次验证筛选得到的阳性克隆；最后通过染色体计数证明筛选得到的阳性克隆，最终获得杂交瘤细胞株2F1。

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F1，其特征在于该杂交瘤细胞株通过如下方法制备：(1)采用纯化的2型猪链球菌05ZYH33的表面蛋白Lmb四次免疫雌性Balb/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；(3)以纯化后的重组Lmb蛋白为抗原包被ELISA板，使用间接ELISA法筛选阳性克隆；再进一步以重组Sao蛋白为抗原,釆用Westernblot法再次验证筛选得到的阳性克隆；最后通过染色体计数证明筛选得到的阳性克隆，最终获得杂交瘤细胞株2F1。2.根据权利要求1所述的分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Lmb单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F1，其特征在于：步骤(1)中选用雌性6周Balb/c小鼠，采用完全弗氏佐剂乳化的重组Lmb蛋白为免疫原，注射蛋白量为100μg/只鼠；间隔2周追加免疫共3次，并改为不完全弗氏佐剂乳化，注射蛋白量保持不变；在融合前3天加强免疫一次，注射蛋白量为100μg/只鼠。3.一种制备分泌抗2型猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘秀珍，高基民，孙卫平，王长军，李先富，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32