一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用。本发明专利技术利用溶藻弧菌噬菌体Vp670和海藻糖等辅剂，开发相应的噬菌体制剂，该噬菌体制剂施用后，会长期持续存在于水体环境中，保持致病的宿主菌与噬菌体数量的平衡，因此，与抗生素相比效果持久、使用量小。本发明专利技术的噬菌体Vp670制剂没有毒副作用，是一种新型绿色的生物消毒制剂，可用于海水养殖动物溶藻弧菌感染防控，促进水产养殖业的健康发展。

Bacteriophage preparation of Vibrio alginolyticus, preparation method and application thereof

The invention discloses a bacteriophage preparation of Vibrio alginolyticus, a preparation method and application thereof. The present invention utilizes V. alginolyticus phage Vp670 and trehalose as adjuvants to develop corresponding bacteriophage agents. After application, the bacteriophage agents will persist in the water environment for a long time and maintain the balance between the number of pathogenic host bacteria and phages. Therefore, compared with antibiotics, the effect is lasting and the dosage is small. The bacteriophage Vp670 preparation has no toxic and side effects, and is a novel green biological disinfectant preparation, which can be used for preventing and controlling the infection of Vibrio alginolyticus in marine cultured animals and promoting the healthy development of aquaculture industry.

【技术实现步骤摘要】
一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用
本专利技术涉及水产养殖
，具体涉及一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用。
技术介绍
细菌性疾病一直困扰着水产养殖业的发展，其中由致病溶藻弧菌爆发引起的流行性疾病对水产养殖业造成巨大经济损失。治疗溶藻弧菌和其他致病菌的常用方法是使用各种抗生素，但在水产养殖中使用抗生素不仅引起食品安全问题，也会引起一系列环境生态问题，包括海洋环境中大量耐药菌的出现以及耐药基因的传播。据统计从海水中分离的大约90％的细菌具有至少一种抗生素抗性，而且大约20％的细菌对于至少5种抗生素具有抗性。因此，急需研制新型抗菌制剂来解决上述问题。噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒，又称细菌病毒，广泛存在于自然界中，它分为烈性噬菌体以及温和噬菌体。烈性噬菌体可在敏感宿主菌内增殖，并使之裂解，也称毒性噬菌体。温和噬菌体基因组整合于宿主菌基因组中，成为细菌DNA的一部分，和宿主核酸同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长。其中，由于烈性噬菌体具有天然的裂菌特性且具有专一性，被认为是一种安全、非常有潜力的生物杀菌剂，近几年由于超级耐药菌的出现以及抗生素的副作用报道增多，噬菌体的研究再次受到重视。噬菌体的专一性和其快速增殖的特点促使其成为治疗细菌性疾病的有力工具。首先，噬菌体的治疗具有特异性，可以针对某一特定有害细菌菌株有选择性的杀灭，从而使生物体内或其生活环境的正常菌群平衡受到最小程度的影响，相比抗生素，其对环境毒副作用小，也保证了食品安全；其次，噬菌体可以随宿主菌的增殖而增殖，并在细菌感染的整个过程中发挥作用，而不像抗生素那样随时间的推移疗效逐渐降低；第三，噬菌体制剂获取方便，价格低廉。目前噬菌体制剂已经受到许多生物技术公司的重视，国外已经有噬菌体药物出现，但噬菌体制剂在水产养殖中的应用还在起步阶段，市场中并未见有水产噬菌体制剂开发，因此噬菌体制剂的应用具有很大的发展潜力。前期工作中，我们已经获得到了噬菌体Vp670，又名ΦPE333，但并未进行感染能力研究和制剂开发，也未指出其应用途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用，该噬菌体制剂具有专一裂解溶藻弧菌的特性，能够特异高效杀灭养殖水体和养殖动物体内的溶藻弧菌，从而起到防治水产动物的作用，不破坏水环境中的其他菌群，不会对养殖动物以及消费者产生任何影响，且能够长期存在水体环境中，保持致病宿主菌与噬菌体数量的平衡。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种溶藻弧菌噬菌体制剂，包括噬菌体Vp670和辅剂，所述辅剂包括海藻糖上述技术方案中的制剂以噬菌体Vp670作为裂解溶藻弧菌的有效成分，具有专一裂解溶藻弧菌的特性，不破坏水环境中的其他菌群，不会对养殖动物以及消费者产生任何影响，且能够长期存在水体环境中，保持致病宿主菌与噬菌体数量的平衡。本专利技术还提供了一种上述溶藻弧菌噬菌体的制备方法，包括以下步骤：(1)将溶藻弧菌菌液与噬菌体Vp670培养液混合，形成混合培养液，摇动培养4～6h；(2)在步骤(1)中的混合培养液加入氯仿，氯仿与混合培养液的体积比为0.05％～0.1％，摇动培养10～15min后；(3)过滤培养液；(4)在步骤(3)的滤液中加入海藻糖，充分混匀，海藻糖与滤液的质量比为0.2％～0.4％，得到所述的噬菌体制剂。专利技术人经过反复试验，优化调整溶藻弧菌噬菌体制剂的制备工艺的各项参数，制备得到对溶藻弧菌具有很强的裂解性的噬菌体制剂。作为本专利技术所述的溶藻弧菌噬菌体制剂的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，包括以下步骤：1)采用LB培养基过夜培养溶藻弧菌E06333，将过夜培养的溶藻弧菌E06333按1％的体积比例接种至新的LB培养基中，培养至OD600nm为0.4，获得溶藻弧菌液；2)取溶藻弧菌液和噬菌体Vp670种子液按24:1的体积比混匀，30℃摇床培养3小时，离心后取上清，获得噬菌体Vp670一级培养液；3)将噬菌体Vp670一级培养液按1％的体积比与溶藻弧菌液混匀，30℃摇床培养3小时，获得噬菌体Vp670二级培养液；4)以VAM培养基过夜培养溶藻弧菌E06333，培养温度30℃；5)将步骤4)的溶藻弧菌E06333培养液按1％的体积比加入到新的VAM培养基中，30℃培养至OD600nm为0.4～0.6；6)将噬菌体Vp670二级培养液按2％～5％的体积比加入到步骤5)的溶藻弧菌E06333培养液中，30℃摇动培养3～5小时，得到混合培养液。作为本专利技术所述的溶藻弧菌噬菌体制剂的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，海藻糖与滤液的质量比为0.3％。本专利技术还提供了上述的溶藻弧菌噬菌体制剂在水产养殖中裂解溶藻弧菌的应用。本专利技术的溶藻弧菌噬菌体制剂以噬菌体Vp670作为主要成分，高效裂解溶藻弧菌，能够用于防治水产养殖中由溶藻弧菌引起的感染和污染。作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，所述应用包括用于水体除菌、用于养殖动物体表除菌中的至少一种。作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，所述应用包括用于水体除菌，按每亩5～10公斤的比例加入噬菌体Vp670制剂，每半月施用一次。作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，所述应用包括用于养殖动物体表除菌，将养殖动物集中于小水体中，按1％～2％的体积比例加入噬菌体Vp670制剂，浸泡30min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术噬菌体Vp670制剂具有专一裂解溶藻弧菌的特性，不破坏水环境中的其他菌群，不会对养殖动物以及消费者产生任何影响；而抗生素在杀灭细菌的同时也会破坏其他浮游生物，引起药物残留以及食品安全等问题；2、本专利技术的噬菌体Vp670制剂施用后，能够长期持续存在于水体环境中，保持致病的宿主菌与噬菌体数量的平衡，与抗生素相比，效果持久、使用量小；3、因为成本和药物残留等问题，抗生素药物不可能用于大面积水体的抑菌，但噬菌体Vp670制剂可以在大面积水体使用；4、本专利技术的噬菌体Vp670制剂获取方便，生产过程环境无污染，价格低廉。附图说明图1为纯化后Vp670噬菌斑图。图2为本专利技术的噬菌体制剂感染溶藻弧菌E06333效果及噬菌体制剂中的噬菌体观察图。其中：A，正常的未感染的溶藻弧菌E06333细胞；B，感染后的溶藻弧菌E06333细胞，箭头所示为大量的病毒粒子。图3为基于DNA聚合酶的噬菌体Vp670种系发生分析图。箭头所指为噬菌体Vp670的位置。图4为溶藻弧菌噬菌体Vp670的一步生长曲线图。图5为溶藻弧菌噬菌体Vp670的吸附速率图。图6为本专利技术的噬菌体制剂用于养殖水体中溶藻弧菌生物控制后水体中细菌数量计数。其中：CP1，对照组水体中TCBS平板显示黄色菌的数量；EP1，实验组水体中TCBS平板显示黄色菌的数量；CP2，对照组水体中溶藻弧菌的数量；EP2，实验组水体中溶藻弧菌的数量。图7为本专利技术的噬菌体制剂用于养殖动物体表除菌效果评价图。其中：CX1，对照组鱼苗体表粘液中用TCBS平板显示黄色菌的含量；EX1，实验组鱼苗体表粘液中用TCBS平板显示黄色菌的含量；CX2，对照组鱼苗体表粘液中溶藻弧菌的数量；EX2，实验组鱼苗体表粘液中溶藻弧菌的数量。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶藻弧菌噬菌体制剂，其特征在于，包括噬菌体Vp670和辅剂，所述辅剂包括海藻糖。

【技术特征摘要】
1.一种溶藻弧菌噬菌体制剂，其特征在于，包括噬菌体Vp670和辅剂，所述辅剂包括海藻糖。2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将溶藻弧菌菌液与噬菌体Vp670培养液混合，形成混合培养液，摇动培养3～5h；(2)在步骤(1)中的混合培养液加入氯仿，氯仿与混合培养液的体积比为0.05％～0.1％，摇动培养10～15min后；(3)过滤培养液；(4)在步骤(3)的滤液中加入海藻糖，充分混匀，海藻糖与滤液的质量比为0.2％～0.4％，得到所述的噬菌体制剂。3.根据权利要求2所述的溶藻弧菌噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，包括以下步骤：1)采用LB培养基过夜培养溶藻弧菌E06333，将过夜培养的溶藻弧菌E06333按1％的体积比例接种至新的LB培养基中，培养至OD600nm为0.4，获得溶藻弧菌液；2)取溶藻弧菌液和噬菌体Vp670种子液按24:1的体积比混匀，30℃摇床培养3小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗鹏，卢泽禹，田雨顺，云龙，朱婉君，
申请(专利权)人：广州诺晶生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44