一种干细胞的保存方法技术

本发明专利技术提供了一种干细胞的保存方法，包括如下步骤：(1)干细胞原代培养：将干细胞转入完全培养基中进行培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；(2)干细胞传代培养：接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3‑5代，收集细胞并计数；(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中培养。所述保存方法能够长时间常温保存脐带间充质干细胞活力，保存24h后细胞活力仍在80％以上。

A method for preservation of stem cells

The invention provides a method for preserving stem cells, which comprises the following steps: (1) primary culture of stem cells: when the stem cells are transferred into a complete medium for culture, but the cell fusion degree is above 80%, digestive enzymes and physiological saline are added into the culture bottle to make the digestive enzymes spread evenly on the cell surface, and when the cells become round, the digestive enzymes stop disappearing. (2) stem cell subculture: inoculated with primary cells for culture, cell density reached more than 80%, and then subcultured to the third to fifth generation, collected cells and counted; (3) preserved stem cells: take stem cells mixed with the preservation solution, placed in the incubator. The preservation method can preserve the viability of umbilical cord mesenchymal stem cells at room temperature for a long time, and the cell viability is still above 80% after 24 hours of preservation.

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞的保存方法
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种干细胞的保存方法，尤其涉及一种保存液组合物用于脐带间充质干细胞的保存方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。MSCs在临床移植治疗中，不能将新鲜分离的干细胞直接输注于人体内，它需要先存放在可以输注的保存液(如0.9％氯化钠注射液)中一定时间，再输注于体内。MSCs在离体情况下活力会渐渐下降，这直接影响了分离的干细胞数量和质量，如何维持离体MSCs的活性成为了当务之急。目前临床常用的保存液有0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液，1％人血白蛋白液等，但MSCs在这些保存液中活性会下降，影响临床的治疗效果。目前的脐带保存方法存在如下问题：1.保存液的由基础的培养基构成，营养成分复杂，且该成分不一定适合脐带在离体情况下的所需；2.保存过程繁琐，条件苛刻；3.对MSCs的保存效果不佳。目前找到一种能够有效保存MSCs的方法是一种亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种干细胞的保存方法，所述干细胞的保存方法能够长时间常温保存脐带间充质干细胞活力，保存24h后细胞活力仍在80％以上。为达此目的，本专利技术采用了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种干细胞的保存方法，包括如下步骤：(1)干细胞原代培养：将干细胞转入完全培养基中进行培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；(2)干细胞传代培养：接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3-5代，收集细胞并计数；(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中培养。本专利技术中，通过采用特定的培养和消化方法，配合特定的保存液，使得干细胞能够在常温下保存，且24h后干细胞活力仍能在80％以上，对干细胞表面标记不产生太大的影响。根据本专利技术，所述干细胞的浓度为1×105-1×107/ml，优选为5×105-5×106/ml，例如可以是1×105/ml、2×105/ml、3×105/ml、4×105/ml、5×105/ml、6×105/ml、7×105/ml、8×105/ml、9×105/ml、10×105/ml、20×105/ml、30×105/ml、40×105/ml、50×105/ml、60×105/ml、70×105/ml、80×105/ml、90×105/ml或100×105/ml，优选为5×105-5×106/ml，进一步优选为2×106/ml。根据本专利技术，步骤(1)所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为36-38℃。根据本专利技术，步骤(1)所述培养的CO2的浓度为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为4-6％。根据本专利技术，所述消化酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶或羧肽酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为胰蛋白酶。根据本专利技术，所述消化酶的质量浓度为0.01-0.1％，例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％，优选为0.06-0.08％。根据本专利技术，步骤(2)所述接种原代细胞的密度为6500-10000个/cm2，例如可以是6500个/cm2、6600个/cm2、6700个/cm2、6800个/cm2、6900个/cm2、7000个/cm2、7200个/cm2、7500个/cm2、7600个/cm2、7800个/cm2、8000个/cm2、8200个/cm2、8500个/cm2、8600个/cm2、8800个/cm2、9000个/cm2、9200个/cm2、9500个/cm2、9800个/cm2或10000个/cm2，优选为7000-9000个/cm2。根据本专利技术，步骤(3)所述保存液按重量份数包括如下组分：生理盐水5-15重量份、人血白蛋白3-6重量份和复方电解质注射液80-95重量份。本专利技术中，通过特定的生理盐水和人血白蛋白的组合，使得保存液组合物能够在常温下保存间充质干细胞，且24h后干细胞活力仍能在80％以上，对干细胞表面标记不产生太大的影响。所述生理盐水的重量份数为5-15重量份，例如可以是5重量份、6重量份、7重量份、8重量份、9重量份、10重量份、11重量份、12重量份、13重量份、14重量份或15重量份，优选为6-10重量份，优选为9重量份。所述人血白蛋白的重量份数为3-6份，例如可以是3重量份、4重量份、5重量份或6重量份，优选为4-6重量份，优选为4重量份。所述复方电解质注射液的重量份数为80-95重量份，例如可以是85重量份、86重量份、87重量份、88重量份、89重量份、90重量份、91重量份、92重量份、93重量份、94重量份或95重量份，优选为85-90重量份，优选为87重量份。根据本专利技术，步骤(1)所述培养箱的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为36-38℃。根据本专利技术，步骤(1)所述培养箱的CO2的浓度为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为4-6％。作为优选技术方案，所述干细胞保存方法，包括如下步骤：(1)干细胞原代培养：将1×105-1×107/ml干细胞转入完全培养基中在35-40℃、3-8％CO2浓度下培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入质量浓度为0.01-0.1％的消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；(2)干细胞传代培养：按接种密度6500-10000个/cm2接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3-5代，收集细胞并计数；(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中35-40℃、3-8％CO2浓度下培养；其中，所述保存液按重量份数包括如下组分：生理盐水5-15重量份、人血白蛋白3-6重量份和复方电解质注射液80-95重量份。第二方面，本专利技术提供如第一方面所述的保存方法用于保存脐带间充质干细胞的用途。根据本专利技术，所述间充质干细胞的浓度为1×105-1×107/ml，例如可以是1×105/ml、2×105/ml、3×105/ml、4×105/ml、5×105/ml、6×105/ml、7×105/ml、8×105/ml、9×105/ml、10×105/ml、20×105/ml、30×105/ml、40×105/ml、50×105/ml、60×105/ml、70×105/ml、80×105/ml、90×105/ml或100×105/ml，优选为5×105-5×106/ml，进一步优选为2×106/ml。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：(1)本专利技术方法干细胞保存后的活力高，24h后细胞活力仍在80％以上，且细胞贴壁能力好，且保存后没有对干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)干细胞原代培养：将干细胞转入完全培养基中进行培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；(2)干细胞传代培养：接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3‑5代，收集细胞并计数；(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中培养。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)干细胞原代培养：将干细胞转入完全培养基中进行培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；(2)干细胞传代培养：接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3-5代，收集细胞并计数；(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中培养。2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述干细胞的浓度为1×105-1×107/ml，优选为5×105-5×106/ml，进一步优选为2×106/ml。3.根据权利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的温度为35-40℃，优选为36-38℃；优选地，步骤(1)所述培养的CO2的浓度为3-8％，优选为4-6％。4.根据权利要求1-3中任一项所述的保存方法，其特征在于，所述消化酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶或羧肽酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为胰蛋白酶；优选地，所述消化酶的质量浓度为0.01-0.1％，优选为0.06-0.08％。5.根据权利要求1-4中任一项所述的保存方法，其特征在于，步骤(2)所述接种原代细胞的密度为6500-10000个/cm2，优选为7000-9000个/cm2。6.根据权利要求1-5中任一项所述的保存方法，其特征在于，步骤(3)所述保存液按重量份数包括如下组分：生理盐水5-15重量份、人血白蛋白3-6重量份和复方电解质注射液80-95重量份；优选地，所述生理...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲海洪，张军，
申请(专利权)人：广州莱德尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44