一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，包括以下组分：重组人白介素‑2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。本发明专利技术采用将重组人白介素‑2(IL‑2)添加到外周血单核细胞冻存液中，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。本发明专利技术在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和海藻糖，可以替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。

A completely serum-free cryopreservation solution for peripheral blood mononuclear cells and its method

The invention relates to a completely serum-free cryopreservation solution for peripheral blood mononuclear cells and a method thereof, comprising the following components: recombinant human interleukin-2, human blood albumin, polyethylene glycol, trehalose, and basic medium or sodium chloride for injection. By adding the recombinant human interleukin_2 (IL_2) to the cryopreservation solution of peripheral blood mononuclear cells, the activity stability of the cultured immune cells after resuscitation can be greatly improved, and the original cells can be maintained with high activity, so that the immune cells can well maintain the physiological function and biological characteristics of the cells after resuscitation and can be effectively understood. The problem of direct scale expansion after cell resuscitation. The polyethylene glycol and trehalose added in the cryopreservation solution of immune cells can replace the existing cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide (DMSO), effectively reduce its cytotoxicity, maintain cell stability, improve the safety of direct application after resuscitation, and is suitable for direct application after cell cryopreservation and resuscitation.

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法
本专利技术涉及细胞冻存
，特别是免疫细胞冻存，尤其涉及外周血单核细胞冻存，具体为一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法。
技术介绍
细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的外周血单核细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是用于单一种免疫细胞研究时。冷冻保存外周血单核细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时外周血单核细胞采集困难，需要多次采血问题，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。选择合适的冷冻保护剂可以避免细胞在冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。目前国内冻存方法多采用的是DMSO、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，例如CN102301992A公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚砜，但不仅限于此，还可以包含动物血清和培养基等成分。采用该冻存液的优点是细胞保存时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的文献，例如，CN104026118A公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用于免疫细胞的扩增培养，而本专利技术采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到外周血单核细胞冻存液中，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。本专利技术在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和海藻糖，可以替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。因此，寻找一种如何保持细胞高活性并可实现长期存储、即时复苏的外周血单核细胞冻存液及冻存方法是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，以解决可以保持细胞高活性并可实现长期存储、即时复苏的外周血单核细胞冻存液及冻存方法的问题。一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于，包括以下组分：重组人白介素-2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。优选的，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；海藻糖0.05-0.3g/ml；人血白蛋白0.01-0.1g/ml基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％。优选的，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的海藻糖含量为0.05-0.3g/mL，例如可以是0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％，所述外周血单核细胞冻存液中的人血白蛋白含量为0.01-0.1g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL、0.1g/mL，当在外周血单核细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白，以及基础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积百分含量之和为100％。优选的，所述外周血单核细胞冻存液包括：重组人白介素-2100-200U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；海藻糖0.1-0.2g/mL；基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。优选的，所述外周血单核细胞冻存液中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基(Gibco)或淋巴细胞培养基[X-VIVOTM15(LONZA)、HIPP-T009(倍谙基)]，且所述淋巴细胞培养基为HIPP-T009(倍谙基)，其均可购自倍谙基公司。优选的，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或CIK细胞中的任意一种。优选的，本专利技术提供了一种外周血单核细胞的冻存方法，包括一下步骤：(1)将外周血单核细胞与本专利技术所述的外周血单核细胞冻存液混合；(2)进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。优选的，所述外周血淋巴细胞优选的冻存方法包括以下步骤：(1)冻存液的制备：制备本专利技术所述的外周血单核细胞细胞冻存液；(2)细胞悬液的制备：将供体资源分离去除血浆，并将下层全血离心分离获得外周血单核细胞，将所述外周血单核细胞与所述外周血单核细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；(3)冻存：将所述冻存管进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；(4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于，包括以下组分：重组人白介素‑2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。

【技术特征摘要】
1.一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于，包括以下组分：重组人白介素-2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。2.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；海藻糖0.05-0.3g/ml；人血白蛋白0.01-0.1g/ml基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％。3.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的海藻糖含量为0.05-0.3g/mL，例如可以是0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％，所述外周血单核细胞冻存液中的人血白蛋白含量为0.01-0.1g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL、0.1g/mL，当在外周血单核细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白，以及基础培养基或注射用氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金，卢彬彬，陶飞龙，唐欢，何丽婷，程征雁，
申请(专利权)人：上海韵飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31