一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术提供了一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法、试剂盒及应用。通过用亚硫酸氢盐处理从人粪便提取得到的DNA片段，利用本发明专利技术的特异性引物对和/或能与待测位点互补的探针，开展实时定量PCR，对样品的LAD1甲基化进行检测。本发明专利技术的检测方法具有高通量特性和高敏感性，且无需在PCR后进行电泳和分子杂交等操作，可减少实验过程中污染和操作误差，还能节约时间和节省试剂消耗，不仅能减少检测成本，提高检测效率，将为结直肠癌早期诊断和无创快速筛查提供有效手段，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法、试剂盒及应用
本专利技术属于生物检测领域，特别涉及一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法、试剂盒及应用。
技术介绍
尽管SPG20、FBN1、VIM等甲基化检测用于结直肠癌的早期诊断，但往往会出现特异性或灵敏性不强的特点。目前常用来进行检测基因甲基化的方法有甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐处理和测序等方法。MS-PCR方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，需要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。亚硫酸氢盐处理和测序一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，改善甲基化检测特异性或灵敏性不强等问题，提供一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种检测粪便LAD1基因甲基化的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供所述的检测粪便LAD1基因甲基化的方法或试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法，从粪便样品中提取DNA，利用特异性引物对LAD1-mF和LAD1-mR进行实时定量PCR，检测待测粪便样本中的LAD1基因启动子区(SEQIDNO.7)第26位和第27位甲基化程度(图1)。其中，LAD1-mF的序列为：GATTATCGGGTGTCGTAGTTC，(如SEQIDNO.1所示)；LAD1-mR的序列为：CCCTAACGCAACGTACGCG。(如SEQIDNO.2所示)。所述的实时定量PCR可为探针法或染料法。当所述的实时定量PCR为探针法时，与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针，包括以下任意序列：(1)TGAGTAGAATAAGGAGAGATTAT，(如SEQIDNO.3所示)(2)ACAACTAACACTTAACATTATAAC。(如SEQIDNO.4所示)当采用荧光染料进行实时荧光PCR时，最佳反应条件为：预变性95℃，10min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环；以每20s升温1℃速率从75℃升温至95℃，得到溶解曲线。当采用荧光探针进行实时荧光PCR时，最佳反应条件为：95℃，20min；50个PCR循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s。所述的检测粪便LAD1基因甲基化的方法，还可以进一步利用如SEQIDNO.5～6所示的引物对进行实时定量PCR对LAD1基因非甲基化的结果进行进一步确认，以进一步提高结果准确性。如果只有甲基化引物发生扩增，说明第26和27位均发生了甲基化；如果甲基化的引物和非甲基化的引物都发生了扩增，说明该位点中只有第26或27位发生了甲基化；如果只有非甲基化引物发生扩增，则说明这两个位点是完全非甲基化。一种检测粪便LAD1基因甲基化的试剂盒，包含所述的特异性引物对。所述的检测粪便LAD1基因甲基化的试剂盒，还可以包括如下用于进一步确认非甲基化结果的引物对：LAD1-uF：AGATTATTGGGTGTTGTAGTTT，(如SEQIDNO.5所示)LAD1-uR：AACCCTAACACAACATACACA。(如SEQIDNO.6所示)所述的检测粪便LAD1基因甲基化的试剂盒，还包含所述的探针或荧光染料。所述的检测粪便LAD1基因甲基化的试剂盒，还可以包括阳性标准品、阴性质控品、PCR反应液、PCR酶中的至少一种。所述的阳性标准品为插入如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的载体质粒。所述的检测粪便LAD1基因甲基化的方法或所述的检测粪便LAD1基因甲基化的试剂盒在结直肠癌检测中的应用。本专利技术拟采用甲基化荧光法对待测样品DNA的中LAD1基因甲基化的检测。采用探针法和染色法对特定甲基化位点进行realtimePCR检测。信号强度与PCR产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。本专利技术利用甲基化荧光法对粪便DNA的中LAD1基因甲基化的检测，作为结直肠癌早期诊断的辅助手段。LAD1为申请人新发现的结直肠癌抑癌基因，免疫组化结果提示它与结直肠癌的TNM分期及淋巴结转移负相关，理论研究提示该基因与结直肠癌细胞的失巢凋亡有关。然而目前就LAD1单独及其联合其他基因作为结直肠癌早期诊断的检测方法尚无研究报道。鉴于LAD1的生物学功能及申请人已有的研究结果成功利用粪便LAD1基因甲基化辅助结直肠癌早期诊断。本专利技术采用甲基化荧光法对粪便DNA的中LAD1基因甲基化的检测，利用PCR引物结合探针或荧光染料来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理从人粪便提取得到的DNA片段，利用本专利技术的特异性引物对和/或能与待测位点互补的探针或荧光染料，随后开展实时定量PCR，对样品的LAD1甲基化进行检测。申请人发现，正常人的待测样品(如血液样品)DNA的LAD1无甲基化化，而结直肠癌患者待测样品(如血液样品)的LAD1甲基化程度显著增加。因此对于今后病人建议对其待测样品(如血液样品)DNA先进行检测，如果发现LAD1甲基化程度显著增加，将建议患者进行内镜等常规检测以便于病情得到确诊。因此，本专利技术可以根据探针与DNA杂交释放出荧光信号来计算样品的甲基化程度。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.本专利技术所使用的检测方法具有高通量特性高敏感性，将为结直肠癌无创快速筛查提供一定的参考。2.本专利技术无需在PCR后进行电泳和分子杂交等操作，不仅能减少实验过程中污染和操作误差，还能节约时间和节省试剂消耗，因此本专利技术不经能减少检测成本，提高检测效率。3.本专利技术所使用的检测方法具有高敏感性等特点，且甲基化的LAD1是结肠癌发生早期就已经出现，该检测方法为结直肠癌早期诊断提供参考。4.本专利技术通过对用实时定量PCR对LAD1基因特定位点的非甲基化和非甲基化的结果双重检测，为确认本检测方法的可靠性和检测结果的准确性提供依据。5.本专利技术通过对用两种实时定量PCR方法进行研究，证明LAD1基因特定位点甲基化检测具有实验可行性，并为临床应用提供重要依据。附图说明图1为LAD1基因启动子区序列示意图。图2为实施例1中引物LAD1-mF、LAD1-mR的荧光定量PCR溶解曲线图和扩增曲线图(结直肠癌患者)。图3为实施例1中内参基因ATCB的荧光定量PCR溶解曲线图和扩增曲线图。图4为实施例1中引物LAD1-uF、LAD1-uR的荧光定量PCR溶解曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法，其特征在于：从粪便样品中提取DNA，利用特异性引物对LAD1‑mF和LAD1‑mR进行实时定量PCR，检测待测粪便样本中的LAD1基因甲基化程度；其中，LAD1‑mF的序列为：GATTATCGGGTGTCGTAGTTC，LAD1‑mR的序列为：CCCTAACGCAACGTACGCG。

【技术特征摘要】
1.一种检测粪便LAD1基因甲基化的方法，其特征在于：从粪便样品中提取DNA，利用特异性引物对LAD1-mF和LAD1-mR进行实时定量PCR，检测待测粪便样本中的LAD1基因甲基化程度；其中，LAD1-mF的序列为：GATTATCGGGTGTCGTAGTTC，LAD1-mR的序列为：CCCTAACGCAACGTACGCG。2.根据权利要求1所述的检测粪便LAD1基因甲基化的方法，其特征在于：所述的实时定量PCR可为探针法或染料法。3.根据权利要求2所述的检测粪便LAD1基因甲基化的方法，其特征在于：当所述的实时定量PCR为探针法时，与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针如SEQIDNO.3～4任一序列所示。4.根据权利要求1～3任一项所述的检测粪便LAD1基因甲基化的方法，其特征在于：还可以进一步利用如SEQIDNO.5～6所示的引物对进行实时定量PCR对LAD1基因非甲基化的结果进...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，李艳红，单嘉杰，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44