一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法。该方法使人胎盘来源的间充质干细胞适应至体外的无血清培养体系，并获得了与有血清培养相似的细胞密度和活率，与现有的人间充质干细胞培养方法相比，更经济、更有效。采用此方法，与血管生长相关的bFGF、PDGF、VEGF表达量比未驯化细胞有所上升。驯化后的细胞可以用于静脉注射的干细胞制剂制备；所驯化细胞的分泌活性因子成分可用作面膜、眼膜、发膜的组分。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法
本专利技术涉及一种人间充质干细胞的培养方法，更具体地说，本专利技术涉及利用一种独特、安全的驯化培养方式达到人间充质干细胞的无血清体外培养。
技术介绍
干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞（humanmesenchymalstemcells,HMSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。间充质干细胞的体外培养工艺是关系到干细胞作为药物或者美容产品使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。现在普遍采用的培养方法有常规的加牛血清的培养方法和无血清培养方法两种。血清培养的方法较为简单，细胞生长状态较好，主要质控对象是血清，但因为加入的血清比例在10-20%之间，存在较大的牛血清蛋白残留的问题。在检索到的专利（包括授权和公开未授权）中，间充质干细胞的培养主要采用DMEM的完全培养基。专利C12N5/0775(2006.01)I提到一种扩增未分化的间充质干细胞(MSC)的方法，其包括：在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养未分化的MSC，其中所述培养基没有另外添加其它生长因子和/或分化因子，从而产生未分化的MSC扩增细胞。无血清培养基虽然成分清晰，但是成本高昂，而且存在干细胞的生长状况不理想等的问题。因此，亟待改进干细胞体外培养的方法，在保障安全性的同时，使细胞获得良好的生长状态，同时还可以降低培养的经济成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种独特的培养方法，为人间充质干细胞的体外培养提供一种无血清驯化的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。*除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为重量百分数。本专利技术提供了一种体外培养的方法，其特征在于，该方法使用新鲜的无血清基础培养基，按照一定的比例添加并置换体外人间充质干细胞的有血清完全培养液，利用间充质干细胞自身在培养过程中分泌的外泌体和微囊成分作为补充，使间充质干细胞完成无血清培养的驯化，最终实现无血清培养体系。驯化后的间充质干细胞的密度及活率、细胞表面的主要标志物与有血清培养基无明显差异，检测培养液及外泌体所分泌的细胞因子的组分和丰度发现，与血管生长相关的bFGF、PDGF、VEGF表达量比未驯化细胞有所上升，表1。收获的细胞可以用于静脉输注，收获的培养上清、外泌体和微囊成分可以用于美容产品的制备。表1：无血清驯化培养的人间充质干细胞各项指标检测项目无血清驯化后细胞（P5）未驯化细胞(P5)密度(个/ml)大于1×106/ml大于1×106/ml活率%90%90%bFGF(pg/ml)2517PDGF(pg/ml)1812VEGF(pg/ml)9.78.5其中，所述的人间充质干细胞主要来源于但不限于人胎盘附属组织，比如羊膜、脐带。添加的无血清基础培养基指但不限于DMEM基础培养基。本专利技术提供了人间充质干细胞的体外无血清驯化培养方法，并鉴定了使用驯化培养收获间充质干细胞在不同时段的特性和生长动力学特征，结果发现，细胞的生长周期，密度和活率与使用完全培养基相比没有明显的差异，收获的间充质干细胞可以用于静脉注射制剂的制备；收获的间充质干细胞外泌体和囊泡，适用于药用干细胞制剂和医美产品的研制；用此方法培养的间充质干细胞，密度可达1x106/ml，活率达到90%以上，109间充质干细胞在体外培养48小时，收获的培养上清中的外泌体的含量大于或等于80mg。经Bio-RadDC检测（detergentcompatibleproteinconcentrationassay）分析，外泌体中包含有血管生长所需要的VEGF、PDGF、bFGF的浓度分别为9.6pg/ml、18pg/ml和25pg/ml。与现有的技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用无血清驯化的方式，对体外培养的人间充质干细胞进行驯化，使其最终适应于无血清培养。在最终的收获阶段，培养基上清中检测到的牛血清白蛋白的含量为20ng/mL，低于或等于生物制品规程中对于牛残含量的要求，大大提高了最终收获细胞的安全性。间充质干细胞适应无血清培养后，除了细胞的生长动力学有所改变外，同等代次的收获细胞的密度和活率，与使用完全培养基相比没有差异。外泌体所分泌的血管生成类细胞活性因子VEGF、PDGF、bFGF的浓度有所上升。利用这种方法，降低了目前使用完全培养基或者无血清培养基方法的成本。使用无血清驯化的方法培养的人间充质干细胞可以开发成为干细胞的注射液，用于干细胞药物的开发，其收获的外泌体和微囊也可以作为开发医美产品，如面膜、眼膜、生发膜等的重要成分。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步清楚地说明，但它们并不是对本专利技术保护范围的限定。实施例1——人间充质干细胞注射液的制备方法，采用以下步骤：胎盘来源MSC细胞主要包括脐带、羊膜来源的间充质干细胞，培养采用以下步骤进行：脐带、羊膜的处理:脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是华通氏胶（Wharton’sJelly），外层由羊膜来源的上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路，已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源。处理方法是首先剥离脐带动静脉和外层上皮，留下凝胶状组织（华通氏胶），切除双侧带夹痕及淤血的部分。羊膜是胎膜最内层，胎盘包裹胎儿面的一层薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁发育而成，在胎盘面与绒毛膜相贴，由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织。消毒:从储液瓶中取出胎盘脐带或羊膜（运输储液：DMEM／F12+1%的双抗50～150ml;运输储存条件4℃），先用75%酒精对组织进行消毒擦拭，然后用漂洗液（不含钙镁但含有双抗的无菌PBS）反复冲洗组织，直到洗净残余血细胞。组织块处理:脐带组织处理：用PBS洗3次，去掉残留的血细胞。把脐带剪切成2.0cm左右的片段并剔除血管（1条脐静脉，2条脐动脉），留下内膜，内膜即为华通氏胶，将其剪成大小约1mm3的组织块（细碎小块；1mm3大小；呈肉糜状，以能用吸管吸取为标准）。羊膜组织处理：用已干烤灭菌的组织剪及手术剪将羊膜剪成大的组织块，一边将大的组织块剪成小块，一边用手术镊或者虎齿镊夹持进行再次进行漂洗，避免溢出，如此重复3遍，至漂洗液清亮，弃漂洗液，用1ml移液枪或者移液器吸尽剩余本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.无血清驯化培养人间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法使人胎盘来源间充质干细胞通过梯度换液的方法，适应于无血清的体外培养体系，并获得了有效的扩增。

【技术特征摘要】
1.无血清驯化培养人间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法使人胎盘来源间充质干细胞通过梯度换液的方法，适应于无血清的体外培养体系，并获得了有效的扩增。2.驯化的人胎盘间充质干细胞用于静脉注射干细胞制剂的制备。3.所驯化细胞的分泌活性因子成分可用作面膜、眼膜、发膜的组分。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘馨，马波，
申请(专利权)人：刘馨，
类型：发明
国别省市：云南,53