人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种人抗‑Gal‑IgG抗体检测试剂盒，属于医药检测技术领域。所述试剂盒中含有特异性人抗‑Gal‑IgG抗体标准品，所述人抗‑Gal‑IgG抗体对于Galα1‑3Gal系列拟糖蛋白和Galα1‑3Gal类似物拟糖蛋白呈现特异性反应；对单糖拟糖蛋白及核心结构拟糖蛋白不反应。采用该试剂盒，能够对人体血清中抗‑Gal‑IgG抗体进行定量检测。可广泛用于临床病人手术后，人体内抗‑Gal抗体的定量检测，以及临床上异种器官移植或者应用了动物源性生物材料治疗后病人血液样本的检测。

Human anti -Gal-IgG antibody detection kit and preparation method and use thereof

The invention relates to a human anti Gal IgG antibody detection kit, which belongs to the field of medical detection technology. The kit contains a specific human anti-Gal_IgG antibody standard, and the human anti-Gal_IgG antibody shows a specific reaction to the Gal_1_3Gal pseudoglycoprotein and the Gal_1_3Gal analogue pseudoglycoprotein, and does not respond to the monoglycoprotein and the core structure pseudoglycoprotein. The kit can be used for quantitative detection of anti Gal IgG antibody in human serum. It can be widely used for the quantitative detection of anti-Gal antibody in clinical patients after operation, as well as for the detection of blood samples of patients after clinical xenotransplantation or the application of animal-derived biomaterials.

【技术实现步骤摘要】
人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和用途
本专利技术涉及医药检测
，特别是涉及一种人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和用途。
技术介绍
近20年来，器官移植技术得到了飞跃的发展，成为治疗各种终末期器官衰竭的最有效途径。然而，器官来源短缺让众多病人在等待器官移植的过程中死去。据悉，我国每年至少有100万人需要接受器官移植，但大约只有1万人做了移植手术。因此，异种器官移植成为科学界研究的热点。在异种器官移植中最大的障碍是供器官异种抗原产生的超急性免疫排斥反应，为解决异种器官组织的免疫排斥反应，脱细胞去除免疫原的动物源性材料被广泛用于外科的创伤修复。然而，动物源性生物材料应用于人体仍面临着慢性免疫排斥反应问题，直接影响着材料应用的安全性和有效性。目前，科学研究已经明确了α-半乳糖基抗原(α-1，3-galactosyle，α-Gal，简称Gal抗原)是异种器官移植超急性免疫排斥反应的主要靶抗原。当含有Gal抗原的器官移植到人体内时，会在短时间内引起超急性免疫排斥反应。即使是脱细胞去除抗原的动物源性生物材料，残留的抗原仍然有刺激体内产生更高的抗-Gal抗体，引起慢性的免疫排斥反应，影响组织的修复。因此，如果通过检测临床上器官移植或者应用了动物源性生物材料植入后病人体内抗-Gal抗体的水平，可以客观的反映出移植的效果，评价手术后的免疫排斥反应风险。然而目前国内外市场上均未见人抗Gal-IgG抗体定量检测的试剂盒或相关产品，为了便于临床科学准确地对异种器官移植或者应用了动物源性生物材料治疗(植入)后病人体内抗-Gal-IgG抗体进行定量监测，亟需开发一种能够对人抗Gal-IgG抗体进行定量检测的方法和产品。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，采用该试剂盒，能够对人体血清中抗-Gal-IgG抗体进行定量检测。一种人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，所述试剂盒中含有特异性人抗-Gal-IgG抗体标准品，所述人抗-Gal-IgG抗体对于Galα1-3Gal系列拟糖蛋白和Galα1-3Gal类似物拟糖蛋白呈现特异性反应；对单糖拟糖蛋白及核心结构拟糖蛋白不反应。上述试剂盒，含有特异性人抗-Gal-IgG抗体标准品，具有非常好的特异性，能够对人体血清中抗-Gal-IgG抗体进行准确的定量检测。在其中一个实施例中，所述Galα1-3Gal系列拟糖蛋白为NGP0334拟糖蛋白和NGP0203拟糖蛋白；所述Galα1-3Gal类似物拟糖蛋白为NGP0330拟糖蛋白和NGP0333拟糖蛋白；所述单糖拟糖蛋白为NGP0105拟糖蛋白；所述核心结构拟糖蛋白为NGP0202拟糖蛋白。上述NGP0334拟糖蛋白可为Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA，NGP0203拟糖蛋白可为Galα1-3Gal-BSA，NGP0330拟糖蛋白可为Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA，NGP0333拟糖蛋白可为Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-BSA；NGP0105拟糖蛋白可为L-Fucose-BSA，NGP0202拟糖蛋白可为Galα1-2Gal-BSA。在其中一个实施例中，所述人抗-Gal-IgG抗体通过以下方法制备得到：免疫亲和纯化：以人工合成的α-Gal-BSA抗原制备免疫亲和柱，将人血清过柱纯化得到免疫亲和纯化抗体；ProteinA纯化：将上述得到的免疫亲和纯化抗体以ProteinA进行纯化，得到纯化的人抗-Gal-IgG抗体。在其中一个实施例中，所述ProteinA纯化步骤中，包括如下步骤：柱平衡：以以8～12倍柱体积的PBS冲洗进行ProteinA柱平衡；上样：室温下将人血清过柱3～5次；清洗：以8～12倍柱体积的PBS冲洗进行清洗；洗脱：先以4～6个柱体积的pH2.7Gly-Cl洗脱液洗脱，以278-282nm为目标抗体吸收波长进行监测，收集目标抗体所在洗脱液，，以PH9.0Tris-Cl中和液中和，即得；保存：保存于50mMGlycine，100mMTris-Cl，150mMNaCl，0.1mMEDTAPH7.4～8的溶液中。采用上述方法制备纯化人抗-Gal-IgG抗体，所得人抗-Gal-IgG抗体具有较好的纯度和特异性。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括：固相Gal抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗液、酶标二抗、显色液A、显色液B和终止液。在其中一个实施例中，所述样品稀释液为含有甘油抗体保护剂的PBS溶液；所述浓缩洗液为10～50倍浓缩的0.05％吐温-20；所述酶标二抗为羊抗人IgG-HRP；所述显色液A通过以下方法制备：取醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL，蒸馏水加至500mL，即得；所述显色液B通过以下方法制备：取乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，溶于3mLDMSO中的0.15gTMB，蒸馏水加至500mL，即得；所述终止液为10％浓硫酸。本专利技术还公开了上述的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒的制备方法，所述固相Gal抗原包被板的制备方法如下：配制1～5μg/mL的Gal-BSA溶液，取96孔板，每孔加入100μL上述溶液，室温低速摇动1～2h，然后转4℃静置过夜，用PBS配制0.05％的吐温-20溶液作为洗液，每孔加入200～300μL洗液，浸泡后甩干，重复3次，之后加入1％的BSA每孔200μL，放入37℃，100rpm震摇，封闭1～2h，最后洗板3～5次，即得到固相Gal抗原包被板；所述人抗-Gal-IgG抗体标准品制备方法如下：免疫亲和纯化：以人工合成的α-Gal-BSA抗原制备免疫亲和柱，将人血清过柱纯化得到免疫亲和纯化抗体；ProteinA纯化：将上述得到的免疫亲和纯化抗体以ProteinA进行纯化，得到纯化的人抗-Gal-IgG抗体。本专利技术还公开了上述的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒在人源性生物材料中人抗-Gal-IgG抗体的检测中的用途。在其中一个实施例中，所述人源性生物材料为人血清。在其中一个实施例中，所述检测为定量测定。本专利技术的人抗-Gal-IgG抗体检测原理为：采用酶联免疫吸附法，利用人工合成的α-Gal-BSA抗原作为固相抗原，以此捕获人血清中的特异性抗-Gal-IgG抗体，再用酶标二抗进行检测，并通过人抗-Gal-IgG抗体标准品制备标准曲线，从而实现定量检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，其中含有特异性人抗-Gal-IgG抗体标准品，具有非常好的特异性，能够对人体血清中抗-Gal-IgG抗体进行准确的定量检测，能够检测浓度范围为1～0.015625μg/mL的标准品，检测结果R2值大于0.99，回收率均满足80％～120％范围，检测结果可信度高。该试剂盒可用于人体内抗-Gal抗体的定量检测，特别是临床上异种器官移植或者应用了动物源性生物材料治疗后病人血液样本中抗-Gal抗体的检测。附图说明图1为实施例1中得到的抗体SDS-PAGE检测结果图；图2为由标准品浓度和吸光度拟合得到的标准曲线。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人抗‑Gal‑IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有特异性人抗‑Gal‑IgG抗体标准品，所述人抗‑Gal‑IgG抗体对于Gal α 1‑3Gal系列拟糖蛋白和Gal α 1‑3Gal类似物拟糖蛋白呈现特异性反应；对单糖拟糖蛋白及核心结构拟糖蛋白不反应。

【技术特征摘要】
1.一种人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有特异性人抗-Gal-IgG抗体标准品，所述人抗-Gal-IgG抗体对于Galα1-3Gal系列拟糖蛋白和Galα1-3Gal类似物拟糖蛋白呈现特异性反应；对单糖拟糖蛋白及核心结构拟糖蛋白不反应。2.根据权利要求1所述的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述Galα1-3Gal系列拟糖蛋白为NGP0334拟糖蛋白和NGP0203拟糖蛋白；所述Galα1-3Gal类似物拟糖蛋白为NGP0330拟糖蛋白和NGP0333拟糖蛋白；所述单糖拟糖蛋白为NGP0105拟糖蛋白；所述核心结构拟糖蛋白为NGP0202拟糖蛋白。3.根据权利要求2所述的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述人抗-Gal-IgG抗体通过以下方法制备得到：免疫亲和纯化：以人工合成的α-Gal-BSA抗原制备免疫亲和柱，将人血清过柱纯化得到免疫亲和纯化抗体；ProteinA纯化：将上述得到的免疫亲和纯化抗体以ProteinA进行纯化，得到纯化的人抗-Gal-IgG抗体。4.根据权利要求3所述的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述ProteinA纯化步骤中，包括如下步骤：柱平衡：以以8～12倍柱体积的PBS冲洗进行ProteinA柱平衡；上样：室温下将人血清过柱3～5次；清洗：以8～12倍柱体积的PBS冲洗进行清洗；洗脱：先以4～6个柱体积的pH2.7Gly-Cl洗脱液洗脱，以278-282nm为目标抗体吸收波长进行监测，收集目标抗体所在洗脱液，以PH9.0Tris-Cl中和液中和，即得；保存：保存于50mMGlycine，100mMTris-Cl，150mMNaCl，0.1mMEDTAPH7.4～8的溶液中。5.根据权利要求1～4任一项所述的人抗-Gal-IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：固相Gal抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗液、酶标二抗、显色液A、显色液B和终止液。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽明，邵安良，吴勇，陈亮，段晓杰，魏利娜，王金恒，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11