褪黑色素在制备治疗椎间盘退变药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于人体激素新用途技术领域，具体涉及褪黑色素在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。本发明专利技术通过应用针扎穿刺来建立大鼠尾椎间盘退变模型，观察褪黑色素对椎间盘退变的治疗作用，通过观察椎间盘退变的各项指标来评估Mel对于椎间盘退变的治疗作用。并且通过免疫组化染色观察大鼠尾椎椎间盘的软骨终板上Mel1型受体和RANKL的表达情况以及TRAP染色来阐明Mel延缓椎间盘退变的简要机制。椎间盘软骨终板的破坏和软骨下骨的丢失增加可能是引起椎间盘退变的重要机制，Mel通过抑制终板软骨细胞表达RANKL，进而减少软骨终板区域的破骨细胞形成来延缓椎间盘退变。

Application of melanin in the preparation of drugs for treatment of intervertebral disc degeneration

The invention belongs to the technical field of a new use of human hormones, in particular to the application of melatonin in the preparation of medicines for treating intervertebral disc degeneration. The invention establishes a rat model of intervertebral disc degeneration by applying needle puncture, observes the therapeutic effect of melatonin on intervertebral disc degeneration, and evaluates the therapeutic effect of Mel on intervertebral disc degeneration by observing various indexes of intervertebral disc degeneration. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of Mel-1 receptor and RANKL on the cartilage endplate of the rat caudal intervertebral disc and TRAP staining was used to elucidate the brief mechanism of Mel delaying intervertebral disc degeneration. The destruction of cartilage endplate and the increase of subchondral bone loss may be important mechanisms of intervertebral disc degeneration. Mel delays intervertebral disc degeneration by inhibiting the expression of RANKL in endplate chondrocytes and thereby reducing the formation of osteoclasts in the area of cartilage endplate.

【技术实现步骤摘要】
褪黑色素在制备治疗椎间盘退变药物中的应用
本专利技术属于人体激素新用途
，具体涉及褪黑色素在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。
技术介绍
椎间盘退变（intervertebraldiscdegeneration,IVDD）是现代社会引起人们腰背痛（Lowbackpain,LBP）的主要原因之一，并且给人的生理、心理和经济带来严重的负担，但是我们对于IVDD发生的具体机制仍不明确，各种非手术治疗的疗效也并不显著，大多数患者需行髓核摘除手术，而且手术具有一定的创伤，因此如何有效地防治IVDD已成为脊柱外科领域的一个重要课题。褪黑色素（Melatonin,Mel）是一种由哺乳动物和人类松果体分泌的激素，通常用于调节机体基本生命活动，如睡眠质量调节，心率调节，体温调节等，但是近期研究表明Mel还具有许多别的功能，例如调节骨代谢，保护软骨细胞等作用。PingZ.等人发现Mel具有通过抑制骨髓来源的巨噬细胞在核因子KB受体活化因子配体（RANKL）诱导下的破骨细胞生成的潜在作用。据报道椎间盘终板软骨细胞的形态和功能与关节软骨细胞相似，并且有研究显示Mel对关节软骨细胞具有明显保护作用，但是目前尚无研究证明Mel对椎间盘退变的作用，本专利技术由此而来。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Mel的新用途，特别是通过与椎间盘终板软骨细胞上的1型Mel受体(Mel-receptor1)结合从而抑制由终板软骨细胞分泌的RANKL诱导其内破骨细胞形成的用途，为预防和治疗椎间盘退变提供了一种新途径。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术提供的技术方案是：本专利技术技术方案首先通过对实验大鼠采用腹腔注射外源性的Mel来研究Mel是否能延缓椎间盘的退变，同时测定椎间盘区域的Mel-receptor1以及RANKL的表达与椎间盘退变治疗的关系，并且通过计算抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示的TRAP阳性细胞百分比来明确Mel对终板软骨细胞的保护作用。本专利技术人通过使用20G针头对60只SD大鼠的第7-8尾椎（Co7-8），第8-9尾椎（Co8-9）和第9-10尾椎（Co9-10）进行针扎穿刺来建立椎间盘退变模型，并将这60只大鼠随机均分为Mel高剂量组（50mg/kg，n=20），Mel低剂量组（5mg/kg，n=20）和PBSVehicle组(n=20)，另外未作任何处理的20只大鼠作为Control组(n=20)。动物实验过程中，实验组成员在每天下午的16时至17时进行腹腔注射操作。分别于术后7d，14d，21d，28d每组随机选取5只大鼠（n=5）进行X-ray和MRI检查，测量椎间盘高度并分析MRI信号强度。随后处死并收集标本进行组织学检查，观察椎间盘的形态学变化，以及通过免疫组化染色测量髓核内II型胶原(ColII)和基质金属蛋白酶-3（MMP-3）含量来分析椎间盘退变程度。另外，通过免疫组化染色观察椎间盘区域的RANKL，Mel-receptor1和终板软骨内TRAP阳性细胞的表达情况。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学分析。本专利技术中的Mel采用本领域常规的方法制备成适用于胃肠道或非胃肠道给药的药物制剂，本专利技术优选将Mel通过人工提取或合成的方式制备成粉剂，用无水乙醇溶解，去离子水稀释后进行腹腔注射，这样可以大大减少手术的创伤。在本专利技术中Mel药物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式或制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1～99%，优选为10～90%；本专利技术所述的药学上可接受的载体为组合物中制剂使用的辅料，可采用本领域常规的辅料，以不和本专利技术活性成分发生反应或不影响本专利技术药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。本专利技术中，组合物的制备方法没有限制，Mel直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成制剂，然后按照本领域常规的方式进行包装，与其它辅料混合制成制剂。本专利技术中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。有益效果：本专利技术结果表明，Vehicle组与Control组相比，椎间盘高度于7d开始出现明显下降（*p<0.05）。MRI检查同X-ray检查相似，也在7d就开始出现信号强度的减弱（*p<0.05），并且随着时间差异变得更加明显。Mel治疗有效的延缓了椎间盘高度的下降（#p<0.05），并且相比于Vehicle组来说，MRI信号强度更强（#p<0.05）。在高剂量治疗组作用更明显，与低剂量组相比，差异有统计学意义（$p<0.05）。另外，相比于Vehicle组，Mel治疗还有效改善了组织形态学测量结果：骨矿物质密度（BMD，mg/cc），骨体积（BV，mm3），骨体积与组织体积的比率（BV/TV％）（#p<0.05），且高剂量组较低剂量组改善更为明显（$p<0.05）。组织学染色发现，Vehicle组和Control组相比，髓核容积变小，髓核细胞明显丢失，纤维环呈现皱褶压缩，组织学评分明显升高（*p<0.05）。Mel治疗有效的保证了髓核细胞的含量，纤维环较Vehicle组来说更加规则，组织学评分明显下降（#p<0.05）。通过免疫组化染色发现Mel治疗组比Vehicle组含有更多的ColII和更少的MMP3（#p<0.05），进一步证明了Mel治疗对椎间盘退变过程中细胞外基质丢失的保护作用。另外，RANKL的免疫组化染色和TRAP染色结果证实，Mel可以有效的减少椎间盘退变过程中终板软骨细胞RANKL的表达及破骨细胞生成（#p<0.05）。该动物实验证实褪黑色素对椎间盘退变有一定的防治作用，可使椎间盘终板软骨细胞上的RANKL表达下降，并减少软骨终板区域的破骨细胞形成。可作为治疗椎间盘退变的一种新手段。附图说明图1为大鼠尾椎X-ray扫描图像以及%DHI趋势统计图。图2为大鼠尾椎MRI-T2加权像扫描图像，以及MRI分级评分。图3为各实验组大鼠尾椎间盘HE染色及番红O快绿染色结果，以及组织学评分。图4为各实验组大鼠尾椎间盘髓核内ColII和MMP3免疫组化染色结果。图5为各实验组大鼠尾椎间盘髓核内Mel-receptor1免疫组化染色结果和Micro-CT扫描图像及分析。图6为各实验组大鼠尾椎间盘髓核内RANKL免疫组化染色结果和TRAP染色结果。具体实施方式具体实施方式：一、材料与方法1、材料1.1试剂及实验设备1.1.1主要药品及试剂褪黑色素（Melatonin,Mel），购自Absin，中国上海；多聚甲醛、PBS、DAB显色剂、苏木素、伊红、无水乙醇、去离子水、10%水合氯醛。CollagenII、MMP3、Mel-receptor1、RANKL抗体，购自abcam，英国，TRAP染色试剂盒，购自Sigma，美国；1.1.2主要仪器X-ray和MRI检查机器（GE，美国）、小动物Micro-CT（SkyScan1176，Aartselaar，比利时），石蜡切片机（Leica2135，德国）、烤片机（L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.褪黑色素在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.褪黑色素在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褪黑色素为通过人工提取或合成的方式制备成的粉剂。3.一种治疗椎间盘退变的药物制剂，其特征在于，包括治疗有效量的褪黑色素和药学上可接受的辅料。4.根据权利要求3所述的一种治疗椎间盘退变的药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶云霞，吴勰星，林佳益，耿德春，毛海青，朱雪松，施勤，杨惠林，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32