猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及医药生物技术领域，具体涉及猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用。所述免疫原性功能多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。通过确定P97蛋白可以在体内诱导抗体反应的免疫原性功能区，在应用时可以去除P97上的非功能区，提高该蛋白表达效率和应用范围。因此对该蛋白应用于早期诊断和将来的疫苗开发均具有重要意。

* immunogenicity functional polypeptide of Mycoplasma pneumoniae P97 protein and its coding gene and Application

The invention relates to the field of medical biotechnology, in particular to * immunogenicity functional polypeptide of Mycoplasma pneumoniae P97 protein and its coding gene and application. The amino acid sequence of the immunogenic functional polypeptide is shown as SEQ ID No.2, SEQ ID No.3 or SEQ ID No.4. By identifying the immunogenic functional region of P97 protein which can induce antibody reaction in vivo, the non-functional region of P97 protein can be removed and the expression efficiency and application range can be improved. Therefore, it is important for the early diagnosis and future vaccine development of the protein.

【技术实现步骤摘要】
猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用
本专利技术涉及医药生物
，具体涉及猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽及其编码基因和应用。
技术介绍
猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是一种广泛流行的只感染猪的支原体，能够引起猪慢性肺炎，导致体重增长缓慢和食物转化率下降，对猪规模化饲养具有重要影响。Mhp的膜蛋白P97是Mhp膜上的一种粘附蛋白，有研究表明，P97是猪肺炎支原体最主要的抗原蛋白之一，Mhp感染时，P97引发的免疫反应早于其他抗原蛋白所引起的免疫反应，其诱导机体产生的IgA和IgM抗体要比其它抗原的抗体早35-60天。目前，已有使用P97在疫苗及诊断方面应用的研究报道，但是这些应用只是基于P97的全基因或者R1区，这些基因或区域在体内诱导抗体反应的特点目前也没有研究报道。有研究表明，对于某一个特定的病原蛋白，当病原感染宿主后并不是整个蛋白均可以诱导抗体免疫反应，只是其中一部分发挥免疫原性功能，这些抗原功能区是作为诊断和疫苗开发的理想靶点。尽管有研究使用MHP的P97蛋白作为诊断靶点和疫苗开发，但是这个蛋白上有哪些免疫原性功能区，目前没有研究报道。由于P97蛋白太大，分子量大小约300kD，这样大的分子表达效率非常低，而且全基因很难表达。如果能知道P97上哪些部分可以在体内诱导抗体反应的免疫原性功能区，我们在应用时可以去除P97上的非功能区，提高该蛋白表达效率和应用范围。因此对该蛋白应用于早期诊断和将来的疫苗开发均具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术通过将猪肺炎支原体P97蛋白编码基因进行DNAseI随机酶切成100-250bp的小片段,然后将这些小片段连接到酵母展示表达载体构建成酵母随机展示文库，通过天然感染猪的高免血清染色后进行流式分选出阳性反应抗原克隆，并通过测序分析这些克隆的编码序列，最后通过分析这些序列后确定P97蛋白的能在体内诱导抗体免疫应答的抗原区。本专利技术的目的是提供猪肺炎支原体P97蛋白上具有免疫原性的功能区域。本专利技术的再一目的是提供上述猪肺炎支原体P97蛋白上免疫原性功能区域的应用。P97氨基酸序列如SEQIDNo.1所示：MSKKSKTFKIGLTAGIVGLGVFGLTVGLSSLAKYRSESPRKIANDFAAKVSTLAFSPYAFETDSDYKIVKRWLVDSNNNIRNKEKVIDSFSFFTKNGDQLEKINFQDPEYTKAKITFEILEIIPDVVNQNFKVKFQALQKLHNGGIAKSDIYEQTVAFAKQSNLLVAEFNFSLKKITEKLNQQIENLSTKITNFADEKTSSQKDPSTLRAIDFQYDLNTARNAEDLDIKLANYFPVLKNLINRLNNAPENKLPNNLGNIFEFSFAKDSSTNQYVSIQNQIPSLFLKADLSQSAREILASPDEVQPVINILRLMKKDNSSYFLNFEDFVNNLTLKNMQKEDLNAKGQNLSAYEFLADIKSGFFPGDKRSSHTKAEISNLLNKKENIYDFGKYNGKFNDRLNSPNLEYSLDAASASLDKKDKSIILIPYRLEIKDKFFADDLYPDTKDNILVKEGILKLTGFKKGPKIDLPNINQQIFKTEYLPFFEKGKEEQAKLDYGNILNPYNTQLAKVGVEALFKGNKNQEIYQALDGNYAYEFGAFKSVLNSWTGKIQHPEKADIQRFTRHLEQVKLGSNSVLNQPQTTKEQVISSLKSNNFFKNGHQVASYFQDLLTKDKLTVLETLYDLAKKWGLETNRAQFPKEVFQYTKDIFAEADKLKFLEGKKKDPYNQIKEIHQLSFNILARNDVIKSDGFYGVLLLPQSVKTELEGKNEAQIFEALKKYSLIENSAFKTTILDKNLLEGTDFKTFGDFLKAFFLKAAQFNNFAPWAKLDDNLQYSFEAIKKGETTKEGKREEVDKKVKELDNKIKGILPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPETTKPVAAKPEAAKPVAAKPVAAKPVATNTNTNTGFSLTNKPKEDYFPMAFSYKLEYTDENKLSLKTPEINVFLELVHQSEYEEQKIIKELDKTVLNLQYQFQEVKVTSEQYQKLSHPMMTEGSPNQGKKAEGAPNQGKKAEGAPSQGKKAEGAPNQGKKAEGAPSQGKKAEGASNQQSTTTELTNYLPELGKKIDEIIKKQGKNWKTEVELIEDNIAGDAKLLYFVLRDDSKSGDPKKSSLKVKITVKQSNNNQELKSK.本专利技术在P97上筛选到3个主抗原区，这些抗原区可以在MHP天然感染过程中诱导产生很强的抗体免疫应答反应，因此可以作为该病原感染的检测靶点。根据本专利技术的具体实施方式，获得猪肺炎支原体P97蛋白的主抗原区为D2、D4和D6，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。鉴定出的D2氨基酸序列，SEQIDNo.2：EKLNQQIENLSTKITNFADEKTSSQKDPSTLRAIDFQYDLNTARNAEDLDIKLANYFPVLKNLINRLNNAPENKLP鉴定出的D4氨基酸序列，SEQIDNo.3：KEGILKLTGFKKGPKIDLPNINQQIFKTEYLPFFEKGKEEQAKLDYGNILNPYNTQLAKVGVEALFKGNKNQEIYQALDGNY鉴定出的D6氨基酸序列，SEQIDNo.4：LDDNLQYSFEAIKKGETTKEGKREEVDKKVKELDNKIKGILPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPETTKPVAAKPEAAKPVAAKPVAAKPVATNTNTNTGFSLTNKPKEDYFPMAFSYKLEYTDENKLSLKTPEINVFLELVHQSEYEEQKI本专利技术还提供了编码上述猪肺炎支原体P97蛋白的主抗原区的基因。本专利技术还提供了包含上述基因的重组载体。本专利技术还提供了包含上述基因重组细胞。本专利技术还提供了上述猪肺炎支原体P97蛋白的主抗原区用于制备诊断猪肺炎病的药物的应用。P97的蛋白质大小为1093个氨基酸，该蛋白用于原核表达非常困难，本专利技术鉴定出的抗原功能区最大只有151个氨基酸，这样小的蛋白在细菌上很容易表达，而且也没有影响这些抗原区在检测诊断中的应用。因此提高了这些诊断抗原的制备效率。附图说明图1显示P97基因的扩增结果，其中，泳道1:P97突变后PCR扩增的片段，泳道2：DL5000DNAladder。图2显示P97基因随机酶切结果，其中泳道1:DL2000DNAladder；泳道2：P97基因用DNaseI随机酶切产物电泳结果。图3显示酵母文库流式分选后的结果。图4显示阳性克隆质粒中P97随机抗原肽中氨基酸分布结果。图5显示抗原区验证的实验结果。图6显示主抗原区的免疫血清的检测结果。具体实施方式实施例11.猪肺炎支原体P97基因的突变和随机化酶切在支原体中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽，其特征在于，所述免疫原性功能多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。

【技术特征摘要】
1.猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽，其特征在于，所述免疫原性功能多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。2.编码权利要求1所述猪肺炎支原体P97蛋白的免疫原性功能多肽的基因。3.包含权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘恒贵，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23