霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法。该试剂盒根据靶序列设计2条探针(一条捕获探针和一条检测探针)，还包括一块包被了poly dT的96孔板、菌液裂解液、裂解缓冲液、杂交液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液。利用本试剂盒在2h内即可完成全部过程，通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果。本发明专利技术可以快速、大量、特异性地检测靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测时间短。

Probes, kits and detection methods for rapid detection of Vibrio cholerae sandwich DNA

The invention discloses a probe, a kit and a detection method for rapid detection of Vibrio cholerae by sandwich DNA hybridization. The kit designed two probes (one capture probe and one detection probe) according to the target sequence, including a 96-well plate coated with poly dT, lysate, lysis buffer, hybridization solution, washing solution, chromogenic solution, termination solution, positive control solution and negative control solution. The kit can complete the whole process within 2 hours, and observe the color change by adding TMB color solution or determine the OD value by multi-functional enzyme marker. The invention can detect target sequence quickly, in large quantities and in specificity, and the operation is simple and convenient. It does not need expensive instruments and reagents, can judge the result by naked eyes, has no technical requirements for operators, and has short detection time.

【技术实现步骤摘要】
霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
本专利技术具体涉及一种VC夹心DNA杂交技术技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。
技术介绍
霍乱弧菌(Vibriocholerae，VC)是霍乱的病原菌，其传播快，发病急，病死率高，可导致感染者剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡。霍乱弧菌引起的食源性疾病已成为当今许多国家面临的公共卫生问题，近200年来，全球共发生过7次霍乱大流行，给人类历史带来了巨大的灾难。霍乱已被《中华人民共和国传染病防治法》定为甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病之一。随着霍乱第7次大流行向西半球的扩展和霍乱弧菌新的致病血清群—O139群的出现，其流行特点发生了变化，也给防治工作带来了许多新的挑战，此时对其在食品安全的快速准确检出显得尤为重要。霍乱弧菌是革兰阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，特殊结构有菌毛，无芽孢，有的菌株(O139)有荚膜，在菌体一端有一根单鞭毛。霍乱弧菌是需氧菌，而且对培养基的营养要求不高，在普通培养基上生长良好，也可利用碱性蛋白胨水进行选择性增菌，在选择性的TCBS培养基上培养，菌落呈黄色，光滑，扁平，中心不透明。根据菌体抗原不同，将霍乱弧菌分成若干O血清群，目前已分出200个以上的O血清群，但仅发现O1群和O139群霍乱弧菌能引发霍乱。霍乱弧菌的常规鉴定通常是在碱性蛋白胨水经选择性增菌，然后通过划线接种TCBS琼脂平板或弧菌显色培养基分离，再经一系列的生物化学检验进行鉴定。传统的生物化学或微生物学方法的分离和鉴定,费时费力,需要长时间的培养和选择性增菌。另外,霍乱弧菌在某些不适合生长的条件下,如营养缺乏、抗生素存在或温度不适时,可形成L型菌或变成球型表型等不可培养状态。由于霍乱弧菌存在这种存活但不可培养状态(viablebutnotculnirallestate,VBNCS),采用传统的免疫学方法和生物学方法都不能全面地检测和鉴定霍乱弧菌。但利用核酸检测的方法,即使在不进行选择性富集培养或纯化的情况下,也可以进行检测检定。因此,基于核酸的检测法比传统的富集培养检测法更具优势。目前国内外尚无利用夹心DNA杂交技术检测VC的试剂盒。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供上述检测用探针的试剂盒的使用方法。为了实现上述第一目的本专利技术采用如下技术方案：该探针包括VC捕获探针和VC检测探针，所述VC捕获探针的DNA序列为SEQIDNO.1，所述VC检测探针的DNA序列为SEQIDNO.2。为了实现上述第二目的本专利技术提供一种VC夹心DNA杂交技术快速检测用试剂盒，它包括一块包被了polydT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：所述一瓶探针液瓶内由以下成分组成：DNA序列为SEQIDNO.1的8μmol/L的VC捕获探针12.5μL；DNA序列为SEQIDNO.2的8μmol/L的VC检测探针12.5μL；合计25μL；裂解液，体积为30μL(所述两瓶浓的菌液裂解液，为干粉状，每瓶需用6mL裂解缓冲液裂解；所述裂解缓冲液，体积为12mL)；所述杂交液，体积为100μL；所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；所述显色液，体积为150μL；所述终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。进一步，在上述试剂盒中，所述阳性对照液，瓶内为VC菌液，体积为5mL；所述阴性对照液，瓶内为非VC菌液，体积为5mL。为了实现上述第三目的本专利技术提供一种VC夹心DNA杂交快速检测方法：包括如下步骤：(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养待检菌48h，获得待检菌液。(2)菌液裂解反应将待检菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了polydT的微孔中，按体积比4:1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针按一定浓度先以体积比1﹕1的比例混合)，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育。温育后用1×PBSTBuffer洗板5次，加150μLTMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL2M的终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明待测菌浓度越高。本专利技术的原理是：根据霍乱弧菌GroEL基因特性，分别设计特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸片段锚定，在检测探针末端标记辣根过氧化物酶，两种探针与目标致病菌靶基因的特异性结合，确保检测结果的准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行OD值的测定，检测灵敏度可达到10CFU/mL样品。夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂交技术与PCR技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的VC检测周期较长，约3～5天，操作繁琐，而本专利技术的试剂盒仅需2小时。本专利技术的优点是(1)、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为模版；(2)、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌groEL基因结合，根据辣根过氧化物酶是否显色就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高：最低检测极限达到10CFU/mL；(5)、鉴定简便：只需通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果，显色液加入微孔后变为蓝色且(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性(6)、用途广：可广泛用于VC的安全快速检测，特别是在食品出入境的快速检测中。附图说明图1VC的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果；图2VC的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果；图3阴阳性对照夹心DNA杂交检测结果；图1中：1：霍乱弧菌；2-13：金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪链球菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴性对照、空白对照。图2中：1、1.0×107CFU/mLVC菌液，2、1.0×106CFU/mLVC菌液，3、1.0×105CFU/mLVC菌液，4、1.0×104CFU/mLVC菌液，5、1.0×103CFU/mLVC菌液，6、1.0×102CFU/mLVC菌液，7、1.0×101CFU/mLVC菌液，8、1.0CFU/mLVC菌液。具体实施方式实施例1，VC夹心DNA杂交技术快速检测试剂盒包括一块包被了polydT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，其特征在于：包括VC捕获探针和VC检测探针，所述VC捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，所述VC检测探针的DNA序列为SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，其特征在于：包括VC捕获探针和VC检测探针，所述VC捕获探针的DNA序列为SEQIDNO.1，所述VC检测探针的DNA序列为SEQIDNO.2。2.霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：包括一块包被了polydT的96孔板、两瓶菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：所述探针液由以下成分组成：DNA序列为SEQIDNO.1的8μmol/L的VC捕获探针12.5μL；DNA序列为SEQIDNO.2的8μmol/L的VC检测探针12.5μL；合计25μL；裂解液，体积为30μL，由所述两瓶菌液裂解液与裂解缓冲液混合制备而成；所述杂交液，体积为100μL；所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；所述显色液，体积为150μL；所述终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。3.根据权利要求2所述霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊，王昱，聂福平，李贤良，王国民，吴蕊，
申请(专利权)人：重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：重庆,50