一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，该方法利用柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因(OMP)在不同柑橘黄龙病菌中高度保守性原理,设计两对特异性引物F3/B3和F1/B1，应用这两对引物对待测样品进行PCR扩增,扩增产物经克隆测序获得长度为447bp的基因片段，经NCBI在线比对该片段能100％覆盖柑橘黄龙病菌外膜蛋白合成酶基因，且一致性为100%。本发明专利技术检测方法所使用的这对引物有别于其它检测技术，可以用于快速精准鉴定柑橘黄龙病。

A nested PCR method for detection of Citrus Huanglong pathogen

The invention discloses a nested PCR method for precise detection of Citrus Yellow Dragon pathogen. Based on the principle that OMP gene is highly conserved in different citrus yellow dragon pathogens, two pairs of specific primers F3/B3 and F1/B1 are designed. The two pairs of primers are used for PCR amplification of the tested samples and the amplified products are cloned. The length of 447 BP gene fragment was obtained by sequencing. Compared with NCBI on-line, the fragment could cover 100% of the outer membrane protein synthase gene of Citrus Yellow Dragon pathogen, and the consistency was 100%. The pair of primers used in the detection method of the invention is different from other detection techniques and can be used for rapid and accurate identification of Citrus Yellow Dragon disease.

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR检测方法
本专利技术涉及一种普通柑橘黄龙病菌的检测方法，尤指检测柑橘黄龙病菌亚洲种的巢式PCR的检测方法。
技术介绍
柑橘黄龙病是一种发生在柑橘韧皮部，对柑橘产业造成毁灭性伤害的世界性柑橘病害，该病一旦发病无药可治，所以被称之为“柑橘癌症”。它是由α－变形菌门（α-Proteobacteria）中不能培养的革兰氏阴性菌CadidatusLiberibacter引发的，它们共有三个亚种，分别是CadidatusLiberibacterasiaticus（缩写为CLas），CadidatusLiberibacterafricanus（缩写为CLaf）CadidatusLiberibacteramericanus（缩写为CLam），分别引发亚洲柑橘黄龙病，非洲柑橘黄龙病及美洲柑橘黄龙病。柑橘黄龙病没有特异性病症，而且至今还没有研发出能根治柑橘黄龙病特效药，因此对该病的防控主要依赖早期诊断性检测。关于柑橘黄龙病菌的检测技术，此前一直根据此病菌的16SrDNA基因采用普通PCR和荧光定量PCR。该两种方法都存在缺陷，普通PCR由于灵敏度过低，经常漏检，而荧光定量PCR又由于灵敏度过高造成检测出大量的假阳性（Kunta,M.,J.V.daGraça,N.Malik,E.S.Louzada,andM.Sétamou.2014.QuantitativedistributionofCandidatusLiberibacterasiaticusintheaerialpartsoftheHLB-infectedcitrustreesinTexas.HortScience49:65-68.）。因此有必要建立一种精准的柑橘黄龙病检测技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种柑橘黄龙病菌快速而精准的PCR检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种柑橘黄龙病菌亚洲种的巢式PCR检测方法，其特点是：根据柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因（OMP）在同一亚种内高度保守性原理设计两对特异性引物（F3/B3和F1/B1）对待测样品进行巢式PCR扩增，最后电泳鉴定；特异性引物为：第一对引物F3/B3:正向引物：5’-GGTTATGCTGCCGTTAAAGTGTC-3’反向引物:5’-AACCAGCCCTTTCAGGAACAAG-3’第二对引物F1/B1:正向引物：5’-TCTGAGGGTGAGCGTAAAACAACTG-3’反向引物:5’-TTGGGAAATAGAATGGCTGCTGAAT-3’。进一步地，所述的柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，具体如下：通过所述第一对引物F3/B3对待测样品做第一轮扩增，F3/B3引物反应条件：94℃预变性4min，然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸70sec，在此条件下进行35个循环，最后72℃再延伸10min，若获得一个长1318bp左右的长片段，再对第一轮扩增产物经稀释25倍后用所述第二对引物F1/B1进行第二轮特异性扩增，第二轮PCR反应条件是：94℃预变性4min，然后95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸30sec，最终扩增产物经电泳鉴定，若获得一个长约447bp左右的片段，则待测样品含有柑橘黄龙病病菌。与现有技术相比，本专利技术的优点是：该本专利技术方法依据柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因（OMP）在不同亚种间变异最大而在亚种内高度保守原理，设计两对引物对待测样品进行巢式PCR扩增，从而大大提高了柑橘黄龙病菌检测的精准度，大大降低了黄龙病菌的假阴性率和假阳性率，能精准的我国柑橘黄龙病进行早期监测。附图说明图1为第一轮PCR扩增产物的BLAST结果。图2为第二轮PCR扩增产物的BLAST结果。图3引物F1/B1的特异性检测（M：MarkDL2000；H：HLB；S:水稻细菌性条斑病菌；K:柑橘溃疡病菌；J：黄瓜细菌性角斑病菌；Y：短小芽孢杆菌）。图4巢氏PCR与普通PCR灵敏度检测结果比较.普通PCR用OI1/OI2引物,巢氏PCR用我们自己设计的两对特异性引物,第一排是OI1/OI2引物普通PCR的电泳结果，第二排是巢式PCR的电泳结果，相同编号体代表相同样品。具体实施方式一、引物的设计：本专利技术人依据柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因（OMP）在不同亚种间变异最大而在亚种内高度保守的原理，设计两对引物进行了巢式PCR扩增。首先从NCBI搜索并下载柑橘黄龙病菌OMP基因，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，找出引物候选区，设计出的两对引物。第一对为稳定性稍低的引物（F3/B3），通过该引物做第一轮PCR扩增，获得一个长1318bp的长片段，第二对引物（F1/B1）为高稳定性且高特异性引物，该引物位于第一轮PCR扩增片段内。因此，我们以第一轮扩增产物稀释25倍后作为第二对引物F1/B1的模板，进行第二轮特异性扩增的，获得一个长约447bp左右的片段，从而大大降低黄龙病菌的假阴性率和假阳性率。第一对引物F3/B3:正向引物：5’-GGTTATGCTGCCGTTAAAGTGTC-3’反向引物:5’-AACCAGCCCTTTCAGGAACAAG-3’第二对F1/B1:正向引物：5’-TCTGAGGGTGAGCGTAAAACAACTG-3’反向引物:5’-TTGGGAAATAGAATGGCTGCTGAAT-3’预期的第一轮PCR终产物大小为1318bp，第二轮PCR产物大小为447bp个碱基。二、柑橘黄龙病菌巢式PCR过程：柑橘黄龙病植株基因组DNA按传统的CTAB法提取。CTAB，TaqDNA酶,dNTPs,PCRBuffer(含Mg2+)及无水乙醇等试剂均购自北京全式金生物技术有限公司。PCR反应体系各主要成分及用量组分初始浓度用量PCRBuffer(含Mg2+)10×2.0μldNTPs10mmol/L1.6μl正向引物12.5pmol/μl0.4μl反向引物12.5pmol/μl0.4μlTaqDNA酶5U/μl0.4μlDNA模板50ng/μl1.0μlddH2O14.2μlF3/B3引物反应条件：94℃预变性4min，然后94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸70sec，在此条件下进行32个循环，最后72℃再延伸10min。此扩增产物稀释25倍后作为引物F1/B1模板，进行第二轮PCR扩增。第二轮PCR反应条件是：94℃预变性4min，然后94℃变性30sec，62℃退火20sec，72℃延伸30sec，在此条件下进行30个循环，最后72℃再延伸7min。三、PCR扩增产物的鉴定：取PCR扩增产物5μl，点样于1.2％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），以DL2,000™DNAMarker或50bpladdermarker作为标准分子参照，以80V的电压于0.5×TAE电泳缓冲液中电泳30min，用凝胶成像系统观测扩增片段大小是否与预期的一致。四、PCR产物序列的鉴定：将第一轮扩增产物和第二轮扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行直接测序分析，测序序列经NCBI数据库的BLAST在线比对。结果表明，第一轮扩增产物能98%的覆盖柑橘黄龙病菌基因核苷酸序列，且同源性为99％（本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，其特征在于：该方法是以两对柑橘黄龙病菌特异性引物对待测样品进行巢式PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为：第一对引物为F3/B3:正向引物：5’‑GGTTATGCTGCCGTTAAAGTGTC‑3’反向引物: 5’‑AACCAGCCCTTTCAGGAACAAG‑3’第二对引物为F1/B1:正向引物：5’‑TCTGAGGGTGAGCGTAAAACAACTG‑3’反向引物: 5’‑TTGGGAAATAGAATGGCTGCTGAAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，其特征在于：该方法是以两对柑橘黄龙病菌特异性引物对待测样品进行巢式PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为：第一对引物为F3/B3:正向引物：5’-GGTTATGCTGCCGTTAAAGTGTC-3’反向引物:5’-AACCAGCCCTTTCAGGAACAAG-3’第二对引物为F1/B1:正向引物：5’-TCTGAGGGTGAGCGTAAAACAACTG-3’反向引物:5’-TTGGGAAATAGAATGGCTGCTGAAT-3’。2.如权利要求1所述的柑橘黄龙病菌的巢式PCR检测方法，其特征在于：PCR反应体系各主要成分及用量组分初始浓度用量PCRBuffer(含Mg2+)10×2.0μldNTPs10mmol/L1.6μl正向引物12.5pmol/μl0.4μl反向引物12.5pmol/μl0.4μlTaqDNA酶5U/μl0.4μlDNA模板50ng/μl1.0μlddH2O14.2μl。3.如权利要求2所述的柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，其特征在于：第一对引物F3/B3反应条件：94℃预变性4min，然后95℃变性30sec，...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪艳云，易图永，罗永阳，戴良英，谭小平，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43