获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种用于原发性肿瘤治疗后检测用的获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法。该获得性细胞克隆的检测试剂盒包括第一荧光探针试剂、第二荧光探针试剂及第三荧光探针试剂；其中，第一荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第二荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，第三荧光探针试剂中检测探针的序列如SEQ ID NO:5所示。该获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法可用于对骨髓样本的ACC情况，尤其是SACC情况进行检测和随访跟踪，检测结果可以结合临床性指标、病理性指标、流式分型指标，为tMDS和tAML的临床早期诊断提供重要依据和参考，更好地指导临床医生对治疗相关性骨髓瘤进行早期诊断干预和治疗。

Detection kit for acquired cell clone and its use method

The invention relates to a test kit for detecting acquired cell clones after treatment of primary tumors and a method for using the kit. The test kit for the acquired cell clone consists of the first fluorescent probe reagent, the second fluorescent probe reagent and the third fluorescent probe reagent. The sequence of the two detection probes in the first fluorescent probe reagent is shown as SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2 respectively, and the sequence of the two detection probes in the second fluorescent probe reagent is shown as SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2 respectively. As shown in SEQ ID NO:3 and SEQ ID NO:4, the detection probe sequence in the third fluorescent probe reagent is shown in SEQ ID NO:5. The acquired cell clone test kit and its usage method can be used to detect and follow up the ACC status of bone marrow samples, especially the SACC situation. The test results can be combined with clinical indicators, pathological indicators and flow cytometry typing indicators, providing an important basis and reference for the early clinical diagnosis of tMDS and tAML. Good guidance to clinicians for early diagnosis, intervention and treatment of treatment related myeloma.

【技术实现步骤摘要】
获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
原发性肿瘤的传统治疗方法主要分为放疗、化疗或者两者一起，而化疗又主要包括烷化剂疗法、嘌呤类似物疗法、蒽醌疗法、利妥昔单抗疗法等。传统的治疗往往会对病人正常细胞产生毒性作用而造成严重的损害，易导致治疗相关性髓细胞瘤(therapy-relatedmyeloidneoplasm，tMN)的发生，如治疗相关性骨髓增生异常综合征(therapy-relatedmyelodysplasticsyndrome，tMDS)和治疗相关性急性髓细胞白血病(therapy-relatedacutemyeloidleukemia，tAML)，一般发生于原发性肿瘤治疗后10年内，中位期为5-7年，根据美国的相关统计，10年的累计发病率约为8％-10％。随着对原发性肿瘤的早发现、早治疗、以及有效新肿瘤治疗药物方案的使用，经治疗的肿瘤病人的存活期延长，治疗相关性髓细胞瘤的病例随之增多。在美国，对治疗相关性髓细胞瘤的早期诊断和治疗早已被列为临床肿瘤病常规管理。近年来，治疗相关性髓细胞瘤在中国也开始被关注，得到越来越多的临床医生和病理学家的重视，因为治疗相关性髓细胞瘤难治，病人的死亡率高且存活期短。治疗相关性髓细胞瘤的特点是难治性和耐药性而导致的短生存期，因而治疗相关性髓细胞瘤的早期诊断和干预，有着非常重要的临床意义。现阶段的治疗相关性髓细胞瘤诊断依据主要包括临床性指标、病理性指标、流式分型指标和细胞遗传分型指标。由于治疗相关性髓细胞瘤是一种复杂的病征，临床诊断时需要结合多种指标的检测结果综合分析，单一指标的检测结果往往只能作为中间诊断结果或参考结果用于辅助分析。获得性细胞克隆(acquiredcytogeneticclone，ACC，又称为获得性细胞遗传克隆或获得性细胞基因组克隆等)是一种细胞遗传分型指标。当异常的细胞遗传克隆仍然处于低水平时，其细胞基因组(cytogenomic)改变仍然处于沉默状态，而没有导致临床表型肿瘤的发生，即缺乏病理细胞形态改变和缺乏任何临床表型，把此正常临床状态下的新的获得性细胞克隆称为沉默型获得性细胞克隆(silentacquiredcytogeneticclone，SACC)；当新的获得性细胞克隆发展到一定的水平时，相关的异常细胞基因组功能被激活并导致治疗相关性髓细胞瘤的产生，如图1所示，此克隆称为激活型获得性细胞克隆(activeacquiredcytogeneticclone，AACC)。从原发性肿瘤治疗开始到AACC发生之间的时间段称为ACC发生期。SACC的发生期比AACC的发生期要长，前者为80个月而后者为47个月。从SACC发展到AACC的过程，血常规的变化首先表现在血红蛋白和血小板数降低，继之发生骨髓的细胞数变化。在细胞遗传分型指标上，世界卫生组织(WHO)于2008年提出了骨髓增生异常综合征(MDS)的初步判定主要依据：7号染色体长臂缺失、5号染色体长臂缺失和13号染色体长臂缺失，分别简写为：del(7q)、del(5q)和del(13q)；或者各自相关的7号、5号和13号染色体的单体，分别简写为：-7、-5和-13；或者其他少见的异常细胞遗传克隆。染色体异常的致癌机理包括：基因组功能的改变；染色体异常导致相关基因表达异常：上升或者减少。沉默型获得性细胞克隆(SACC)的临床评估标准为：1)证实ACC的存在；2)出现ACC，但在骨髓形态学评估下没有出现骨髓细胞形态患者细胞表面抗体自身免疫异常；3)出现ACC，但没有治疗相关性骨髓瘤的任何临床表现。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种用于原发性肿瘤治疗后检测用的获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法。一种获得性细胞克隆的检测试剂盒，包括第一荧光探针试剂、第二荧光探针试剂及第三荧光探针试剂；其中，所述第一荧光探针试剂和所述第二荧光探针试剂均为双色荧光探针试剂，所述第三荧光探针试剂为单色荧光探针试剂，且所述第一荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述第二荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，所述第三荧光探针试剂中检测探针的序列如SEQIDNO:5所示。在其中一个实施例中，所述获得性细胞克隆的检测试剂盒还包括以下溶液中的至少一种：固定液、秋水仙素溶液、KCl溶液、吉姆萨母液、胰酶溶液、SSC洗液、NP40裂解液、DAPI染色液和胃蛋白酶溶液。在其中一个实施例中，所述固定液是体积比为1:3的冰醋酸与甲醇的混合液。在其中一个实施例中，所述秋水仙素溶液的浓度是20μg/ml。在其中一个实施例中，所述KCl的浓度是0.075mol/L。在其中一个实施例中，所述胰酶的浓度是0.5wt％。一种获得性细胞克隆的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：将骨髓样本细胞固定在预冷的玻片上；分别使用第一荧光探针试剂、第二荧光探针试剂及第三荧光探针试剂对是固定的骨髓样本细胞进行荧光原位杂交；使用荧光检测仪检测杂交结果。在其中一个实施例中，所述获得性细胞克隆的检测试剂盒的使用方法还包括对固定的骨髓样本细胞进行G带分析的步骤。在其中一个实施例中，在荧光原位杂交之前还包括对固定有骨髓样本细胞的玻片依次进行预处理、蛋白酶处理及脱水处理的步骤。在其中一个实施例中，所述获得性细胞克隆的检测试剂盒的使用方法还包括对获得的骨髓样本进行封闭式培养，收获所述骨髓样本细胞的步骤。上述获得性细胞克隆的检测试剂盒及其使用方法可用于对骨髓样本的ACC情况，尤其是SACC情况进行检测和随访跟踪，检测结果可以结合临床性指标、病理性指标、流式分型指标，为tMDS和tAML的临床早期诊断提供重要依据和参考，更好地指导临床医生对治疗相关性骨髓瘤进行早期诊断干预和治疗。附图说明图1为获得性细胞克隆和治疗相关性髓细胞瘤的发生情况示意图，其中ACC：获得性细胞遗传克隆；SACC：沉默型获得性细胞遗传克隆；tMN：治疗相关性髓细胞瘤；ActiveACC：激活型获得性细胞遗传克隆。图2为沉默型获得性细胞遗传克隆跟踪、治疗相关性髓细胞瘤早期诊断的流程，图中，SACC:沉默型获得性细胞遗传克隆；AACC:激活型获得性细胞遗传克隆；tMN:治疗相关性髓细胞瘤；临床试验实检查：主要包括病理骨髓检查、外周血常规检查、流式检查等。图3为5号染色体长臂缺失的G显带。图4为5号染色体FISH，其中稍亮的代表7号染色体，稍暗的代表5号染色体。图5为7号染色单体缺失的G显带。图6为7号染色体FISH，其中稍亮的代表7号染色体，稍暗的代表5号染色体。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得性细胞克隆的检测试剂盒，其特征在于，包括第一荧光探针试剂、第二荧光探针试剂及第三荧光探针试剂；其中，所述第一荧光探针试剂和所述第二荧光探针试剂均为双色荧光探针试剂，所述第三荧光探针试剂为单色荧光探针试剂，且所述第一荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述第三荧光探针试剂中检测探针的序列如SEQ ID NO:5所示。

【技术特征摘要】
1.一种获得性细胞克隆的检测试剂盒，其特征在于，包括第一荧光探针试剂、第二荧光探针试剂及第三荧光探针试剂；其中，所述第一荧光探针试剂和所述第二荧光探针试剂均为双色荧光探针试剂，所述第三荧光探针试剂为单色荧光探针试剂，且所述第一荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述第二荧光探针试剂中两条检测探针的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，所述第三荧光探针试剂中检测探针的序列如SEQIDNO:5所示。2.如权利要求1所述的获得性细胞克隆的检测试剂盒，其特征在于，还包括以下溶液中的至少一种：固定液、秋水仙素溶液、KCl溶液、吉姆萨母液、胰酶溶液、SSC洗液、NP40裂解液、DAPI染色液和胃蛋白酶溶液。3.如权利要求2所述的获得性细胞克隆的检测试剂盒，其特征在于，所述固定液是体积比为1:3的冰醋酸与甲醇的混合液。4.如权利要求2所述的获得性细胞克隆的检测试剂盒，其特征在于，所述秋水仙素溶液的浓度是20μg/ml。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆国辉，
申请(专利权)人：陆国辉，
类型：发明
国别省市：广东,44