一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体为一种提高解淀粉芽孢杆菌Q‑426环脂肽类抗生素产量的方法。主要技术方案如下：(一)采用Fmoc固相法合成Pre‑ComX P10；(二)制备信号分子ComX P10；(三)解淀粉芽孢杆菌Q‑426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10；所述的解淀粉芽孢杆菌是发明专利技术人在辽宁省大连市的堆肥中分离得到，经传统和分子生物学方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。本发明专利技术在生物体系外采用化学合成的方法大量得到Pre‑ComX P10，添加到解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，通过人工调控提高解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的产量。

A method to increase the production of cyclic lipopeptide antibiotics of Bacillus amylus Q-426

The invention relates to the technical field of biomedicine, in particular to a method for increasing the yield of cyclolipid antibiotics of Bacillus amylolytica Q_426. The main technical schemes are as follows: (1) Pre ComX P10 was synthesized by Fmoc solid-phase method; (2) signal molecule ComX P10 was prepared; (3) signal molecule ComX P10 was fermented by Bacillus amylolytica Q 426, and signal molecule ComX P10 was added in the fermentation process; (2) Bacillus amylolytica was isolated from the compost of Dalian, Liaoning Province by the inventor, and was traditionally obtained. And molecular biology methods were identified as Bacillus amylus Bacillus amyloliquefaciens. Pre_ComX P10 was synthesized by chemical synthesis outside the biological system, and was added to the fermentation process of Bacillus amylolytica to improve the production of lipopeptide antibiotics of Bacillus amylolytica by artificial regulation.

【技术实现步骤摘要】
一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法。
技术介绍
自1943年青霉素被发现并应用于临床治疗以来，为人类治疗和战胜感染性的疾病起到了重要的作用。近年来，随着人类在疾病治疗过程中抗生素的滥用以及动物饲料中过度添加抗生素，出现了多种耐药性超级致病菌，现有的抗生素已无法控制耐药性超级病原菌的感染，对人类健康造成了极大的危险。据相关资料报道，由于抗生素药品滥用而产生的“超级耐药性细菌”到2050年每年将威胁百万中国人的生命安全，此外还将为中国造成20万亿美元的损失。环脂肽是由微生物发酵产生的一类双亲性化合物，其一端由多个氨基酸组成的肽环形成亲水基，另一端由脂肪烃链形成亲油基。它们具有独特的化学结构和生理功能。环脂肽类化合物主要由革兰氏阳性芽孢杆菌代谢产生，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗支原体、降低胆固醇等生物活性。由于环脂肽化合物具有广谱抗菌活性，其抗菌机理不同于目前上市的任何一类抗生素，临床上表现出高效、低毒、不易产耐药性的特点，使其在医药领域具有良好的应用前景。但是，由于发酵液中同时存在多种环脂肽及其同系物，且每种环脂肽的含量较低，因此大量获得高纯度的产品难度很大。目前，仅放线菌来源的环脂肽化合物达托霉素的开发较为成功，2003年9月首次在美国上市，用于万古霉素抗性的粪肠球菌及对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的治疗。研究表明，解淀粉芽孢杆菌中的ComP/ComA双组份信号调控系统对其环脂肽类化合物的分泌具有重要的调节作用。该系统属于典型的群体感应系统(QuorumSensingSystem，QS)如附图1所示，ComX信号分子的前体Pre-ComX经ComQ蛋白作用异戊烯基化后，形成成熟的ComX分子并被分泌到胞外；当其浓度累积到一定阈值时，即可与细胞膜上的受体组氨酸激酶蛋白ComP结合，使其发生自磷酸化；磷酸化的ComP将磷酸基团转移至转录调控因子ComA，被磷酸化的ComA与srfA操纵子的启动子结合，进一步激活该操纵子的转录。ComX信息素的前体物质是整个信号通路的基础，该物质为5-15个氨基酸残基组成的多肽分子。如能在生物体外采用化学合成的方法大量得到Pre-ComX，则有望实现人工调控解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的产量。
技术实现思路
本专利技术提供了一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法。通过Fomc固相合成法，人工合成具有10个氨基酸残基的直链前体肽Pre-ComXP10，将其与ComQ蛋白作用后，得到ComP/ComA双组份信号转导系统的信号分子ComXP10。将信号分子ComXP10与解淀粉芽孢杆菌Q-426共同培养，人工增强该菌ComP/ComA信号转导通路的信号强度，从而促进其环脂肽类抗生素的产量。本专利技术的技术方案如下：一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，包括如下步骤：(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComXP10，所述Pre-ComXP10的氨基酸序列为YKWDGGFSIV；(二)制备信号分子ComXP10；(三)解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComXP10；所述的解淀粉芽孢杆菌是专利技术人在辽宁省大连市的堆肥中分离得到，经传统和分子生物学方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。所述的解淀粉芽孢杆菌Q-426已于2010年9月17日提交保藏，具体保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年9月17日；保藏编号：CCTCCNO.M2010237。所述的解淀粉芽孢杆菌Q-426(Bacillusamyloliquefaciens)的形态特征为：菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，Gram染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。所述ComXP10的化学式为：所述Pre-ComXP10的化学式为：H2N-VISFGGDWKY-COOH。进一步的，所述步骤(一)的具体过程为：以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComXP10从2-CTC树脂上切割下来；所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Val-OH；所述三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的体积比为95：4：1。进一步的，所述步骤(二)的具体过程为：将Pre-ComXP10与香叶基焦磷酸铵、ComQ在缓冲体系中反应生成ComXP10；所述ComQ的制备方法如下：利用化学转化法将重组质粒转入重组大肠杆菌BL21(E.coliBL21(RIL))感受态细胞，并于含有氨苄霉素的LB固体培养基上过夜培养，当OD600在0.6-1.2之间时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，30℃培养8h后收集菌体，将收集的菌体用缓冲液悬浮后进行超声破碎，以13000rpm转速离心50min，得到上清液，将上清液依次经金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到ComQ蛋白。进一步的，所述步骤(三)中：向发酵培养液中添加ComXP10后培养72h。本专利技术的有益效果如下：本专利技术在生物体外采用化学合成的方法大量得到Pre-ComXP10，添加到解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，通过人工调控提高了解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的产量。附图说明图1为ComP/ComA群体感应系统图。图2为Pre-ComXP10的质谱图。图3为Pre-ComXP10的质谱图。图4为解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽粗提物抑菌实验结果；其中：A、实例一，B、实例二，C、实例三。图5为环脂肽液相色谱图；其中：A、实例一，B、实例二，C、实例三。图6为实例一平行试验液相色谱图。图7为实例二平行试验液相色谱图。图8为实例三平行试验液相色谱图。图9为环脂肽产量对比图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步的说明，若无特殊说明，本专利技术所用原料及设备均为本领域的常规技术。实施例1一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，包括如下步骤：(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComXP10以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComXP10从2-CTC树脂上切割下来；所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高解淀粉芽孢杆菌Q‑426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)采用Fmoc固相法合成Pre‑ComX P10，所述Pre‑ComX P10的氨基酸序列为YKWDGGFSIV；(二)制备信号分子ComX P10；(三)解淀粉芽孢杆菌Q‑426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10；所述解淀粉芽孢杆菌Q‑426保藏编号为CCTCC NO.M 2010237；所述ComX P10的化学式为：

【技术特征摘要】
1.一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComXP10，所述Pre-ComXP10的氨基酸序列为YKWDGGFSIV；(二)制备信号分子ComXP10；(三)解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComXP10；所述解淀粉芽孢杆菌Q-426保藏编号为CCTCCNO.M2010237；所述ComXP10的化学式为：所述Pre-ComXP10的化学式为：H2N-VISFGGDWKY-COOH。2.如权利要求1所述的提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，所述步骤(一)的具体过程为：以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComXP10从2-CTC树脂上切割下来；所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、...

【专利技术属性】
技术研发人员：权春善，张丽影，吴懿，王路路，范圣第，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21