鳜鱼亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法技术

本发明专利技术公开了鳜鱼亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法，试剂盒包括扩增20个微卫星位点的引物。本发明专利技术利用微卫星标记与PCR技术结合，筛选了20个高度多态性微卫星位点，对鳜鱼家系进行高通量个体识别和亲子关系分析；本发明专利技术一次PCR反应可以检测4或5个位点，相对简单的单位点检测，效率提高了4倍以上，费用下降为原来的三分之一左右；通过测序仪分型，克服了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型中等位基因大小判读误差的问题，提高了基因型数据的准确性，分析结果表明，99％待测个体能够正确找到其父母本；本发明专利技术的建立为鳜鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
鳜鱼亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种利用微卫星标记技术对鳜鱼进行亲子鉴定的技术，具体为鳜鱼亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。
技术介绍
鳜鱼(Sinipercachuatsi)又名翘嘴鳜，是中国优质的淡水养殖鱼类，也是特有的肉食性鱼类，具有生长快、易于饲养、营养价值高等优点。随着鳜鱼养殖业规模的发展和扩大，一些养殖户由于忽略了鳜鱼亲本的选育和保种，导致鳜鱼近亲繁殖严重，从而使得鳜鱼养殖群体的种质资源退化严重、抗病能力下降。为了防止种质资源退化、遗传多样性的降低，在育种过程中确认亲本的系谱信息具有非常重要的作用。分子标记是种质资源鉴定、家系选育和放流效果评估等研究和应用中的一个重要技术手段。目前已有研究将线粒体DNA、随机扩增多态性DNA、微卫星DNA等标记应用于鳜鱼种质资源研究，但都是在群体水平的应用，而个体识别分析还不能实现。然而，家系选育中，了解整个家系遗传多样性、子代与亲代的对应关系以及子代与子代的关系，对指导亲本选留，从而避免近亲杂交、种质衰退有重要的作用。同样，在增殖放流工作中，需要了解回捕个体与放流个体的对应关系，以评估放流的效果。对个体识别可以采用物理标记的办法，但这种办法对于幼鱼具有很大局限性，或因为幼体太小无法标记，或因为标记对幼体生存产生较大影响。因此选用有效的分子标记，实现个体识别和亲子关系鉴定是鳜鱼良种选育和放流效果评估工作中的一种可靠、高效的方法。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，构建一种可靠、高效的鳜鱼亲子鉴定方法，防止鳜鱼近亲繁殖，优化鳜鱼的种质资源，提高其遗传多样性和抗病能力，本专利技术提供了鳜鱼亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。技术方案：鳜鱼亲子鉴定试剂盒，试剂盒包括扩增20个微卫星位点的引物，所述20个微卫星位点为：S26、S27、S29、S31、S32、S34、S38、S44、S50、S57、S62、S82、S91、S95、S97、S99、S51、S64、S69、S96。优选的，所述微卫星位点的引物序列为：S26、SEQIDNO.1～2；S27、SEQIDNO.3～4；S29、SEQIDNO.5～6；S31、SEQIDNO.7～8；S32、SEQIDNO.9～10；S34、SEQIDNO.11～12；S38、SEQIDNO.13～14；S44、SEQIDNO.15～16；S50、SEQIDNO.17～18；S57、SEQIDNO.19～20；S62、SEQIDNO.21～22；S82、SEQIDNO.23～24；S91、SEQIDNO.25～26；S95、SEQIDNO.27～28；S97、SEQIDNO.29～30；S99、SEQIDNO.31～32；S51、SEQIDNO.33～34；S64、SEQIDNO.35～36；S69、SEQIDNO.37～38；S96、SEQIDNO.39～40。微卫星位点及引物序列的具体信息如表1所示。以上所述的鳜鱼亲子鉴定试剂盒在鳜鱼亲子鉴定、家系管理或放流效果监测中的应用。鳜鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：(1)鳜鱼个体DNA提取剪取鳜鱼鳍条或其他组织，采用常规酚-氯仿的方法或者高盐法提取基因组DNA，并将DNA稀释至100ng/μL；(2)鳜鱼多态性微卫星引物的筛选根据文献发表的鳜鱼微卫星引物序列，合成引物，并分别对20个野生鳜鱼个体进行扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的引物；根据引物的退火温度、等位基因大小以及引物序列，设计成不同的多重PCR，共筛选出扩增以下20个鳜鱼微卫星位点的引物：S26、S27、S29、S31、S32、S34、S38、S44、S50、S57、S62、S82、S91、S95、S97、S99、S51、S64、S69、S96；(3)鳜鱼微卫星PCR条件的优化和扩增将上述筛选出来的20对引物，进行PCR扩增，反应体系为25μL：1uL50ng/μLDNA酶，上、下游引物各0.5μL，引物浓度为20μmol/mL，2.5μL10×buffer(Mg2+)，2μLdNTPMix，0.25μLTaq酶，18.25μLddH2O；PCR扩增反应程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃继续延伸1min；最后置于4℃下保存；用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的条带，待电泳结束后，用硝酸银进行染色，染色结束后进行显色，显色完成后相机拍照并读取目的条带基因型，确定等位基因片段大小；(4)亲子鉴定将PCR产物在测序仪上进行分型，读取个体等位基因大小，排成数字基因型矩阵，采用软件Cervusv3.0对数据进行分析，根据待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定待测个体与亲本之间的亲子关系。优选的，步骤(3)中琼脂糖凝胶的浓度为1.5％，聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％。表120对微卫星引物的序列和特征有益效果：(1)本专利技术利用微卫星标记与PCR技术结合，筛选了20个高度多态性微卫星位点，对鳜鱼家系进行高通量个体识别和亲子关系分析；(2)本专利技术一次PCR反应可以检测4或5个位点，相对简单的单位点检测，效率提高了4倍以上，费用下降为原来的三分之一左右；(3)通过测序仪分型，克服了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型中等位基因大小判读误差的问题，提高了基因型数据的准确性，分析结果表明，99％待测个体能够正确找到其父母本；(4)本专利技术的建立为鳜鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。附图说明图1是S31引物在混合家系中的扩增结果图；其中M为DL2000的DNAmarker，从左至右依次为1-50个子代个体；图2是20个微卫星位点的亲权排除率示意图。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1鳜鱼亲子鉴定试剂盒，试剂盒包括扩增20个微卫星位点的引物，所述20个微卫星位点为：S26、S27、S29、S31、S32、S34、S38、S44、S50、S57、S62、S82、S91、S95、S97、S99、S51、S64、S69、S96。所述微卫星位点的引物序列为：S26、SEQIDNO.1～2；S27、SEQIDNO.3～4；S29、SEQIDNO.5～6；S31、SEQIDNO.7～8；S32、SEQIDNO.9～10；S34、SEQIDNO.11～12；S38、SEQIDNO.13～14；S44、SEQIDNO.15～16；S50、SEQIDNO.17～18；S57、SEQIDNO.19～20；S62、SEQIDNO.21～22；S82、SEQIDNO.23～24；S91、SEQIDNO.25～26；S95、SEQIDNO.27～28；S97、SEQIDNO.29～30；S99、SEQIDNO.31～32；S51、SEQIDNO.33～34；S64、SEQIDNO.35～36；S69、SEQIDNO.37～38；S96、SEQIDNO.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鳜鱼亲子鉴定试剂盒，其特征在于，试剂盒包括扩增20个微卫星位点的引物，所述20个微卫星位点为：S26、S27、S29、S31、S32、S34、S38、S44、S50、S57、S62、S82、S91、S95、S97、S99、S51、S64、S69、S96。

【技术特征摘要】
1.鳜鱼亲子鉴定试剂盒，其特征在于，试剂盒包括扩增20个微卫星位点的引物，所述20个微卫星位点为：S26、S27、S29、S31、S32、S34、S38、S44、S50、S57、S62、S82、S91、S95、S97、S99、S51、S64、S69、S96。2.根据权利要求1所述的鳜鱼亲子鉴定试剂盒，其特征在于，所述微卫星位点的引物序列为：S26、SEQIDNO.1～2；S27、SEQIDNO.3～4；S29、SEQIDNO.5～6；S31、SEQIDNO.7～8；S32、SEQIDNO.9～10；S34、SEQIDNO.11～12；S38、SEQIDNO.13～14；S44、SEQIDNO.15～16；S50、SEQIDNO.17～18；S57、SEQIDNO.19～20；S62、SEQIDNO.21～22；S82、SEQIDNO.23～24；S91、SEQIDNO.25～26；S95、SEQIDNO.27～28；S97、SEQIDNO.29～30；S99、SEQIDNO.31～32；S51、SEQIDNO.33～34；S64、SEQIDNO.35～36；S69、SEQIDNO.37～38；S96、SEQIDNO.39～40。3.权利要求1所述的鳜鱼亲子鉴定试剂盒在鳜鱼亲子鉴定、家系管理或放流效果监测中的应用。4.鳜鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)鳜鱼个体DNA提取剪取鳜鱼鳍条或其他组织，采用常规酚-氯仿的方法或者高盐法提取基因组DNA，并将DNA稀释至100ng/μL；(2)鳜鱼多态性微卫星引物的筛选根据文献发...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁炜东，邴旭文，颜元杰，曹哲明，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32