一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的生物标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的双链DNA生物标志物及其应用。该标志物是特异性来源于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤血清外泌体的基因组双链DNA片段。该双链DNA可以表征嗜铬细胞瘤/副神经节瘤易感基因中体细胞突变频率高的RET、VHL、HIF2A和与转移表型相关的SDHB变异情况。患者外周血中循环的外泌体DNA包含与其来源肿瘤细胞相同的97％染色体位点信息。本发明专利技术提供了嗜铬细胞瘤/副神经节瘤血清外泌体中双链DNA存在的依据，该双链DNA可用于鉴定肿瘤细胞中存在的突变，为嗜铬细胞瘤/副神经节瘤临床诊断与术前评估提供一种无创性分子标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的生物标志物及其应用
本专利技术属于肿瘤诊断与治疗领域，具体涉及一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的外泌体来源双链DNA生物标志物。
技术介绍
嗜铬细胞瘤/副神经节瘤是来源于肾上腺髓质嗜铬细胞的一种罕见内分泌肿瘤。约有50-80％的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤与至少12个基因(NF1,RET,VHL,SDHA,SDHB,SDHC,SDHD,SDHAF2,TMEM127,MAX,HIF2A,FH)的种系突变或体细胞突变有关。此外，随着突变检测数据的不断积累，21个新描述的基因已被证明与嗜铬细胞瘤/副神经节瘤发生密切相关。与其它肿瘤相比，嗜铬细胞瘤/副神经节瘤具有显著的遗传易感性。易感基因突变的基因型与它们的临床表型一一对应。12个易感基因中，最常见的突变基因为NF1、VHL、HIF2A、RET和SDHB,且SDHB突变与40～60％的转移性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤相关。相类似地，其它易感基因突变也表现出独特的基因型-表型关联。嗜铬细胞瘤/副神经节瘤12个易感基因的种系突变被推荐用于所有嗜铬细胞瘤/副神经节瘤的临床诊断，包括具有家族遗传史高风险发病者、具有综合征特点者、多发肿瘤者、恶性肿瘤者，及具有上述多个特征者。嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者的术前应该进行易感基因突变评估：(1)优化手术方案，降低手术风险，提高生存率；(2)根据评估风险提供个性化治疗方案并进行精准治疗；(3)有利于转移肿瘤的早期诊断与手术方案制定。最新研究表明，超过三分之一嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者中可检测到RET,NF1,VHL,MAX,HIF2A,HRAS等体细胞突变。因此易感基因的体细胞突变检测也被建议纳入对嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者的早期诊断与术前评估。但相对于种系突变检测而言，体细胞突变检测仍然依赖肿瘤组织样品，这极大限制了术前评估与早期诊断基因检测的进行。因此，发展液体活检技术对嗜铬细胞瘤/副神经节瘤的早期诊断与术前评估具有重要的临床意义，而现有技术中，相关研究为技术空白，亟待解决。外泌体是一种直径在50-150纳米的细胞外囊泡，由细胞经过"内吞-融合-外排"而形成，广泛存在于体液中。肿瘤微环境中的外泌体可能在促进细胞间相互作用中发挥关键作用。其所携带的生物学信息，期望用于以液体活检为检测手段的肿瘤早期诊断。然而，来源于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者的外泌体是否携带能够反映与其来源相同肿瘤细胞的遗传信息仍然未知。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的外泌体来源双链DNA生物标志物。该标志物是特异性来源于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者的外周血血清外泌体的基因组双链DNA片段。通过测序鉴定、iPLEX突变分析、二代测序和生物信息学比对分析，该双链DNA可以表征嗜铬细胞瘤/副神经节瘤易感基因中体细胞突变频率高的RET、VHL、HIF2A和与转移表型相关的SDHB变异情况。所述外泌体双链DNA包含与其来源肿瘤细胞97％相同的染色体点突变信息。上述技术方案中，所述外泌体来源双链DNA生物标志物，来源于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤相关细胞系、突变移植瘤裸鼠动物模型血清、嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者血清。其中，所述的双链DNA生物标志物为双链DNA片段。上述技术方案中，具体的优选方案为，所述的双链DNA片段的提取过程为：先用DNaseI处理外泌体样品以消化外部DNA，优选的处理条件为：于室温下消化10-25分钟；再用RNaseA消化外部RNA；用EDTA进行螯合；再按照外泌体溶液与蛋白酶K溶液1:20～100的体积比添加蛋白酶K，在50-60℃消化DNaseI、RNaseA及其它外部蛋白5-20分钟。优选的情况下，所述蛋白酶K的加入量按照外泌体溶液与蛋白酶K溶液1:20～40的体积比添加；消化温度为56℃；消化时间为10分钟。上述技术方案中，具体的优选方案为，所述外泌体，其分离过程为，对收集到的PC12细胞的培养基、突变移植瘤裸鼠血清、嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者血清，分别进行外泌体提取。具体的，所述的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤相关细胞系的外泌体提取方法为：取嗜铬细胞瘤/副神经节瘤相关细胞系的培养基4℃、3000-5000rpm离心10-20分钟，去除细胞碎片及死细胞，然后取上清进行100000-150000g差速离心1-5小时；取沉淀洗涤后再以100000-150000g离心60-120分钟；收集沉淀重悬即得。具体的，所述的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者血清进行外泌体提取的方法为：将外周血样品首先进行4℃、3000-5000rpm离心5-20分钟，收集血清；将收集到的血清再次进行3000-5000rpm离心5-20分钟后，取上清进行100000g-120000g超速离心1-5小时、洗涤、重悬即得。一般情况下，上文外泌体提取方法中所述的沉淀洗涤，常选用中性缓冲液洗涤，例如：采用PBS溶液洗涤1-3次。本专利技术的另一方面，在于公开了上述技术方案中所述的生物标志物在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估中的应用。本专利技术的另一方面，还公开了上述技术方案中所述的生物标志物，在检测嗜铬细胞瘤/副神经节瘤易感基因中的体细胞突变频率高的RET、VHL、HIF2A以及与转移表型相关的SDHB变异情况中的应用。本专利技术的另一方面，还公开了一种嗜铬细胞瘤/副神经节瘤易感基因检测试剂盒，其包括用于检测上文所述的生物标志物的检测试剂。对于上文所述的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤易感基因检测试剂盒，其中所述的生物标志物检测试剂包括DNaseI、RNaseA、EDTA、蛋白酶K。对于上文所述的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤易感基因检测试剂盒，其使用方法包括如下步骤：DNaseI于室温下处理外泌体样品，以消化外部DNA；用RNaseA消化外部RNA；用EDTA进行螯合，1:20-100加入蛋白酶K在50-60℃消化DNaseI、RNaseA及其它外部蛋白5-20分钟。具体说明：上文所述的DNaseI、RNaseA的用量并未注明，因为其用量是本领域技术人员的公知常识，一般情况下，本领域技术人员可以以“消化外部DNA”“消化外部RNA”为目的，调整DNaseI、RNaseA的使用量和使用时间。本专利技术的有益效果：1)本专利技术首次揭示并提供了嗜铬细胞瘤/副神经节瘤血清外泌体中主要含有双链DNA片段存在的依据；2)本专利技术提供的来源于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤外泌体的双链DNA可用于鉴定肿瘤细胞中存在的突变，为嗜铬细胞瘤/副神经节瘤临床诊断与术前评估提供一种无创性分子标志物；3)根据本专利技术实施例中的检测数据分析可知，利用本专利技术所述方法从外泌体DNA中检测到的RET、HIF2A、VHL、SDHB突变与嗜铬细胞瘤/副神经节瘤的肿瘤体细胞突变是完全一致的；外泌体DNA与其肿瘤基因DNA有高度的一致性；因此，本专利技术提供的检测技术可为术前筛查嗜铬细胞体细胞突变提供有效的方法。附图说明图1对来源于PC12细胞系、突变移植瘤裸鼠血清、嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者血清的外泌体的电镜表征；其中，exo-DNAI、exo-DNAII、exo-DNAIII分别表示分离自PC12细胞外泌体DNA、鼠血清外泌体DNA和患者血清外泌体DNA；图2蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的生物标志物，其特征在于：所述的生物标志物为嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者外周血血清外泌体中含有的基因组双链DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于嗜铬细胞瘤/副神经节瘤早期诊断和术前评估的生物标志物，其特征在于：所述的生物标志物为嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者外周血血清外泌体中含有的基因组双链DNA片段。2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于：所述的双链DNA片段的提取过程为：先用DNaseI处理外泌体样品以消化外部DNA；用RNaseA消化外部RNA；用EDTA进行螯合，再按照外泌体样品与蛋白酶K1:20～100的体积比添加蛋白酶K，50-60℃消化5-20分钟。3.根据权利要求2所述的生物标志物，其特征在于：所述蛋白酶K按照外泌体样品与蛋白酶K为1:20～40的体积比添加。4.根据权利要求2所述的生物标志物，其特征在于：所述的蛋白酶K消化温度为56℃；消化时间为10分钟。5.根据权利要求1～4中任一项所述的生物标志物，其特征在于：所述外泌体提取的方法为：取嗜铬细胞瘤/副神经节瘤突变患者外周血样品，于4℃、3000-5000rpm离心5-20分钟收集血清；将收集到的血清再次进行3000-5000rpm离心5-20分...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶，王亮，马静云，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21