一种血清miRNA组合的微创检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种血清miRNA组合的微创检测试剂盒。该试剂盒联合使用miR‑626、miR‑1537‑3p、miR‑4286和miR‑5100作为口腔鳞癌分子标记物，通过曲线拟合判断单个个体的miR‑626、miR‑1537‑3p、miR‑4286和miR‑5100的联合表达水平。本试剂盒检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种血清miRNA组合的微创检测试剂盒
本专利技术属于血清标志物检测
，涉及一种血清miRNA组合的微创检测试剂盒。
技术介绍
miRNA作为生物分子标志物虽然具有独特的优势，但也存在一些技术问题。如果样本量越大，独立检测队列越多，那么miRNA预测准确性越高，越接近肿瘤人群整体的特征，但大样本的收集与处理存在一定难度，原因是入组样本有一定要求，符合要求样本不易收集，样本保存记录工作量大。目前主流筛选候选标志miRNA分子的手段一般是高通量方法初筛，然后再用即时聚合酶链式反应进行验证。虽然方法稳定，技术上比较成熟，但也容易出现一些假阳性结果。利用探针法检测候选miRNA分子，在提升检测特异性的同时，也会降低实验灵敏度，一定程度上会存在漏诊率，且不同批次样本与实验试剂之间也会存在一些差异，而影响结果。人体是一个复杂的体系，单一miRNA预测存在一定的误诊及漏诊率，找寻肿瘤特异性的miRNA也是问题关键，只有检测出肿瘤来源的miRNA，并对其进行分析才能更好的预测患者预后。目前，同类型标志物试剂盒多数以检测组织样本为主，且属于有创检查。并且，同类型血清检测分子通常为蛋白质，是一类容易降解，含量低，且受到检测方法限制的大分子物质，无法准确预测患者预后。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，其目的在于提供一种用于口腔鳞癌诊断及预后并且含有特定血清标志物的微创检测试剂盒。为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：miR-626、miR-1537-3p、miR-4286和miR-5100联合使用作为口腔鳞癌分子标记物的应用，该应用不用于疾病的诊断和治疗，判断的方法为：Y＝0.586×CmiR-626+0.407×CmiR-1537-3p+0.401×CmiR-4286+0.408×CmiR-5100；其中，CmiR-626为单个个体100ul血清中miR-626的表达量，CmiR-1537-3p为该个体100ul血清中miR-1537-3p的表达量，CmiR-4286为该个体100ul血清中miR-4286的表达量，CmiR-5100为该个体100ul血清中miR-5100的表达量；当Y≤5.282时，判断为低表达值或低风险值；当Y＞5.282时，判断为高表达值或高风险值。其中，miR-626的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，miR-1537-3p的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，miR-4286的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，miR-5100的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。一种口腔鳞癌miRNA检测试剂盒，其包括：总RNA抽提体系、PCR反转录体系、定量PCR体系；所述总RNA抽提体系含有植物来源的ath-miR159a作为后继定量PCR检测时的标定外参；所述PCR反转录体系含有TaqManmiRNAAssay探针引物；所述定量PCR体系含有分别针对miR-626、miR-1537-3p、miR-4286和miR-5100的扩增引物。其中，针对miR-626的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，ID：001559。针对miR-1537-3p的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，ID：000338。针对miR-4286的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，ID：476406_mat。针对miR-4286的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，ID：477923_mir。外参引物ath-miR159a的核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，ID：478096_mir。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：第一、本专利技术针对的样本是人体血清，而非人体组织，属于微创检测。第二、本专利技术将miR-626、miR-1537-3p、miR-4286和miR-5100联合使用作为组合分子标记物，经过大数据临床验证实验，在口腔鳞癌的辅助诊断指标方面具有突出优势。这四个分子标记物首次应用于口腔鳞癌miRNA检测试剂盒的开发，可以实现口腔鳞癌的辅助诊断，提高患者的生存率。第三、本专利技术的口腔鳞癌miRNA检测试剂盒选择了miR-626、miR-1537-3p、miR-4286和miR-5100这四个miRNA标记物联合使用，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。第四、本专利技术的口腔鳞癌miRNA检测试剂盒针对血清中作为定量反应的内参，不同样本中差异很大的因素，特别引入稳定的植物来源的RNA序列ath-miR159a作为外参对照RNA，极大提高了进行miRNA检测时相对定量的准确度。总之，本专利技术的新型口腔鳞癌患者的诊断和预后预测试剂盒，采用多个miRNA分子组合，提高检测的灵敏度和特异性，降低单一分子预测试剂盒带来的检测误差，从而提高口腔鳞癌患者预后预测的可靠性，是一种为口腔鳞癌患者预后预测提供微创、高效、可靠的分子标志物试剂盒。附图说明图1为本专利技术的关于miR-626的受试者工作特征曲线。图2为本专利技术的关于miR-1537-3p的受试者工作特征曲线。图3为本专利技术的关于miR-4286的受试者工作特征曲线。图4为本专利技术的关于miR-5100的受试者工作特征曲线。图5为本专利技术的关于miR-626和miR-5100组合的受试者工作特征曲线。图6为本专利技术的关于miR-626的总体生存曲线。图7为本专利技术的关于miR-1537-3p的总体生存曲线。图8为本专利技术的关于miR-4286的总体生存曲线。图9为本专利技术的关于miR-5100的总体生存曲线。图10为本专利技术的关于miR-626的另一条受试者工作特征曲线。图11为本专利技术的关于miR-1537-3p的另一条受试者工作特征曲线。图12为本专利技术的关于miR-4286的另一条受试者工作特征曲线。图13为本专利技术的关于miR-5100的另一条受试者工作特征曲线。图14为本专利技术的关于miRNA组合的另一条受试者工作特征曲线。具体实施方式本专利技术采用了赛默飞世尔科技(中国)有限公司的产品，包括总RNA(核糖核酸)抽提试剂(PN：A27828)、PCR反转录试剂(PN：4366596)、PCR定量试剂(PN：4427788)以及TaqManmiRNAAssays(货号：4440887；ID：001559；ID：000338；ID：476406_mat；ID：477923_mir；ID:478096_mir)。本专利技术的试剂盒的使用方法包括如下步骤：(1)、针对100ul人血清样本进行总RNA抽提，抽提过程中外源性地加入植物来源的ath-miR159a，作为后续定量PCR检测实验的标定外参。(2)、将抽提得到的总RNA利用TaqMan探针引物进行RNA反转录，得到特异性的miRNA分子样本。这一步是本试剂盒的关键步骤之一，这一步利用探针的高特异性，大大提高了后续试剂盒检测过程中的特异性。(3)、接下来将反转录得到的样本，进行探针法定量PCR反应，得到健康正常对照，以及肿瘤患者预后好坏的相对表达值，进行统计分析。其中，本专利技术的试剂盒含有与口腔鳞癌有关的四个miRNA分子，为miR-626、miR-153本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR‑626、miR‑1537‑3p、miR‑4286和miR‑5100联合使用作为口腔鳞癌分子标记物的应用，该应用不用于疾病的诊断和治疗，判断的方法为：Y＝0.586×CmiR‑626+0.407×CmiR‑1537‑3p+0.401×CmiR‑4286+0.408×CmiR‑5100；其中，CmiR‑626为单个个体100ul血清中miR‑626的表达量，CmiR‑1537‑3p为该个体100ul血清中miR‑1537‑3p的表达量，CmiR‑4286为该个体100ul血清中miR‑4286的表达量，CmiR‑5100为该个体100ul血清中miR‑5100的表达量；当Y≤5.282时，判断为低表达值或低风险值；当Y＞5.282时，判断为高表达值或高风险值。

【技术特征摘要】
1.miR-626、miR-1537-3p、miR-4286和miR-5100联合使用作为口腔鳞癌分子标记物的应用，该应用不用于疾病的诊断和治疗，判断的方法为：Y＝0.586×CmiR-626+0.407×CmiR-1537-3p+0.401×CmiR-4286+0.408×CmiR-5100；其中，CmiR-626为单个个体100ul血清中miR-626的表达量，CmiR-1537-3p为该个体100ul血清中miR-1537-3p的表达量，CmiR-4286为该个体100ul血清中miR-4286的表达量，CmiR-5100为该个体100ul血清中miR-5100的表达量；当Y≤5.282时，判断为低表达值或低风险值；当Y＞5.282时，判断为高表达值或高风险值。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：miR-626的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；miR-1537-3p的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；miR-4286的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；miR-5100的成熟核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。3.一种口腔鳞...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐骎，石剑波，鲍欣，刘增赢，陈万涛，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31