杂交瘤细胞株、CD31单克隆抗体、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种杂交瘤细胞株、CD31单克隆抗体、制备方法及应用，该单克隆抗体采用纯化的CD31重组胞外区蛋白作为免疫原免疫动物体；将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞。其分泌产生的抗人CD31单克隆抗体具有特异性强、亲和力高、稳定性好、效价高的特点。

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株、CD31单克隆抗体、制备方法及应用
本专利技术涉及生物医学
，并且更具体地，涉及到一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，CD31单克隆抗体，以及该抗体的制备方法和应用。
技术介绍
白细胞分化抗原31，(ClusterOfDifferentiation31，CD31)，是一种分子量为130KDa的糖蛋白，也称为血小板内皮细胞粘附因子-1(PECAM)。CD31蛋白主要表达于内皮细胞的胞质和胞膜，血小板、单核细胞、粒细胞、B淋巴细胞也有表达，常用于良、恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别诊断，也可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。CD31抗体染色血管内皮细胞后，可清楚地确定肿瘤血管的轮廓，能够容易地找到血管，从而减少寻找范围，提高检验效率。研究发现，肿瘤的生长与转移依赖于肿瘤新生血管的形成，恶性肿瘤生长早期无血管形成，随着瘤体的增大，肿瘤内出现微小的新生血管，肿瘤将进一步获得增殖的能力，并具有侵袭、转移的潜能，组织内血管新生的程度与肿瘤的生长、侵袭和转移有密切关系。此外，肿瘤血管不同于正常血管，血管内皮细胞形态异常、间距增大，肿瘤组织的微血管密度不仅可以定量反应肿瘤血管生长情况，还能预测肿瘤生长、转移和复发趋势。CD31作为血管内皮细胞标记物，可通过标记CD31蛋白精确定位肿瘤血管。因此，血管内皮标志CD31在肿瘤生长和转移中作用的深入研究，可以为肿瘤的治疗和预测提供帮助。免疫组织化学(IHC)是通过抗体与所识别的组织或细胞中的抗原成分的特异性结合，利用化学反应使标记于抗体上的示踪剂(如荧光素、酶、生物素、重金属离子等)显色，对组织切片或细胞薄片上的抗原(多肽及蛋白质)进行定性、定位的染色技术。近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认识的不断深入，免疫组化在肿瘤的分子诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。在免疫组化中，CD31是主要用于证明内皮细胞组织的存在，用于评估肿瘤血管生成，反应肿瘤生长的程度。主要用于良恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别诊断，亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。目前抗肿瘤血管生成治疗已成为肿瘤治疗的常用方法，检测肿瘤血管生长情况也备受关注。目前国内外CD31抗体多以多克隆抗体为主，单克隆抗体制备成本高，稳定性较差，因此，获得稳定、特异性强、活性高的用于免疫组化检测的CD31单克隆抗体对于临床诊断和科学研究有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，目的在于提供一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，CD31单克隆抗体，以及该抗体的制备方法和应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术实施例公开了一株可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其于2018年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201822。另一方面，本专利技术的实施例还公开了一种CD31单克隆抗体的制备方法，其包括：步骤(1)采用真核表达的CD31重组胞外区蛋白作为免疫原免疫动物体；具体地，可采用胞外重组CD31蛋白作为免疫原，所述重组CD31蛋白为人工程细胞表达的CD31蛋白。对Balb/c小鼠进行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，其中首次免疫将CD31蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合做免疫原，第二次免疫和第三次免疫将CD31蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化混合做免疫原，所述加强免疫将CD31蛋白作为免疫原，各免疫原的量和注射体积均不发生改变。步骤(2)将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；具体地，可将骨髓瘤细胞SP2/0与Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞以一定比例混合，以聚乙二醇1450为促融合剂，形成融合的杂交瘤细胞，以未免疫的雌性Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，以含1×HAT的1640培养基为选择培养基，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养。步骤(3)筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞；具体地，可采用间接ELISA法进行筛选，用CD31重组胞外区蛋白包被酶标板，酶标仪检测450nm波长检出阳性克隆，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，筛选出能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。步骤(4)获得CD31单克隆抗体。进一步地，步骤(4)中，所述获得CD31单克隆抗体包括：在动物体内接种所述稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞，生产腹水抗体进行纯化，得到CD31单克隆抗体；或者体外培养所述稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞，分离纯化培养液，得到CD31单克隆抗体。进一步地，步骤(3)中，所述筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆包括：用CD31重组胞外区蛋白包被酶标板，用酶标仪检测450nm波长检出阳性克隆。进一步地，步骤(3)中，所述克隆化采用有限稀释法进行。第三方面，本专利技术实施例还提供由上述方法制备得到的CD31单克隆抗体。第四方面，本专利技术实施例还公开了上述的CD31单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。进一步地，应用于免疫组化检测时，以肿瘤组织免疫组化染色，筛选出可以与人的CD31分子特异性反应的单克隆抗体，可以用于良恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别，也可以用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。本专利技术的有益效果是：本专利技术获得的CD31单克隆抗体与现有技术常用的单克隆抗体免疫组化结果相比，准确率高，效价高，阳性强度高于市面上一般抗体，符合临床检测标准，可对预测肿瘤生长、转移和复发趋势，以及肿瘤治疗提供帮助。高活性的CD31单克隆抗体对于临床诊断和科学研究有重要意义，其应用人的CD31蛋白为免疫原，免疫动物体如Balb/c小鼠，采用细胞融合技术，通过ELISA筛选获得稳定分泌CD31单抗的杂交瘤细胞，克隆号为4H3。可通过收集腹水或体外培养纯化获得抗体，对肝细胞癌、肾上腺嗜铬瘤、上皮样血管肉瘤组织免疫组化染色，染色背景清晰，无非特异性染色，本专利技术对内皮细胞标志CD31具有高识别能力。附图说明图1A-图1C为本专利技术的几种克隆号(2-A10、4-H3、10-A6)对应的单克隆抗体用于肝细胞癌组织免疫组化实验的部分阳性结果(放大400倍)，显示4H3对应的单克隆抗体在相同条件下表达效果最佳。图2A-图2C为本专利技术的克隆号为4H3的单克隆抗体与中杉公司、迈新公司抗体在肾上腺嗜铬瘤免疫组化的部分阳性结果(放大400倍)，显示本专利技术与商品用抗体对抗原定位一致，特异性一致。图3为本专利技术的单克隆抗体在上皮样血管肉瘤组织免疫组化的部分阳性结果，其中，3A为所述阳性结果放大40倍的显微图，3B为所述阳性结果放大200倍的显微图，3C为所述阳性结果放大400倍的显微图。图4为Westernblot(免疫印迹法)验证本专利技术所述4H3单抗的特异性，M为蛋白Marker，应用纯化的4H3单克隆抗体可以在WB中特异地检出CD31重组蛋白(北京义翘：10148-H08H)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术所公开的可稳定产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201822。

【技术特征摘要】
1.一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201822。2.一种CD31单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：步骤(1)采用纯化的CD31重组胞外区蛋白作为免疫原免疫动物体；步骤(2)将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；步骤(3)筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞；步骤(4)获得CD31单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆通过ELISA法进行。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述动物体为Balb/c小鼠。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述获得CD31单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡瑞丽，何荫良，许柳，蓝妮娜，
申请(专利权)人：富恩生物技术成都有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51