肺炎克雷伯氏菌的杀菌性单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性识别肺炎克雷伯氏菌O1的D‑半乳聚糖‑II抗原的人或人源化单克隆IgG抗体(mAb)(其特征在于杀菌性CDC活性)、其生产方法、医学和诊断用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肺炎克雷伯氏菌的杀菌性单克隆抗体
本专利技术涉及杀菌性单克隆抗体(mAb)，其为特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的LPS侧链内的D-半乳聚糖-II(半乳聚糖II、D-galII、gal-II)的人IgG1抗体，及其医疗用途。专利技术背景肺炎克雷伯氏菌是导致泌尿道感染、肺炎和败血症的医院内机会致病菌，其导致显著的发病率和死亡率。易感患者的免疫功能往往受损，而无法应对由该共生肠细菌引起的侵袭性感染。更令人惊恐的是，最近出现了多重耐药(MDR)菌株并在全球蔓延，而对此的治疗方法有限。单克隆抗体可能代表新的治疗方法。尽管如此，考虑到屏蔽大多数表面抗原的体积庞大的荚膜多糖，肺炎克雷伯氏菌表面上可接近的分子靶标非常有限。另一方面，容易接近的荚膜多糖显示出高度的结构变异性和因此显示出高度的抗原变异性，使其对广谱抗菌方法不具有吸引力。另一种主要的非蛋白质表面抗原是比荚膜抗原表现出更少变异性的LPS。在肺炎克雷伯氏菌中，根据LPSO-侧链的结构，存在少于10个O-血清组区别。最常见的血清型是O1，据报道其由三分之一以上的全部肺炎克雷伯氏菌分离株表达(1；2)。Held等人描述了鼠半乳聚糖-II-特异性鼠IgG2b(MabRu.O1)，其能够诱导补体依赖性调理吞噬杀伤但缺乏补体介导杀伤能力，因此在不存在吞噬细胞时不是杀菌性的(1)。包括最近在不同地理位置分离的MDR菌株的内部研究证实O1分离株的患病率最高(图1)。天然存在的抗体由两条重链和两条轻链组成。在IgG中，抗原结合片段(Fab)区含有互补位，并且可以通过与抗原的结合作用发挥直接效应。此外，Fc区与各种辅助分子相互作用以介导间接效应子功能，比如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(也称为调理吞噬作用(OPK))和补体依赖性细胞毒性(CDC)。后两种Fc介导的效应子功能对传染性疾病尤其重要，其中细胞和补体介导的应答对高效病原体清除是重要的。在补体依赖性细胞毒性(CDC)中，C1q与抗体结合，并且该结合触发补体级联，由于经典途径补体激活，其导致在靶细胞表面形成膜攻击复合物(C5b至C9)。对于人IgG1和IgG3，CDC效应子功能的水平通常较高，对于IgG2则较低，对于IgG4则无效，但主要取决于靶细胞和抗原的类型。在大多数临床流行的肺炎克雷伯氏菌血清型中，D-半乳聚糖II提供了定义O1抗原的表位，其特征在于D-galII重复单元结构：[-3)-α-D-Galp-(1–3)-β-D-Galp-(1-]。它的存在负责细菌在宿主中抵抗补体介导杀伤。仅产生D-半乳聚糖I的肺炎克雷伯氏菌突变体因此对血清敏感(13)。吞噬细胞是能够吸收、吞没(吞噬)和消化颗粒、微生物或死亡细胞的细胞。专职吞噬细胞包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞。肺炎克雷伯氏菌O1抗原的详细生物化学结构早先由两个独立的小组描述(11；12)。如上所述(1-3)，Trautmann小组提出并表征了针对肺炎克雷伯氏菌O1抗原的多克隆和鼠单克隆IgG2a抗体。基于他们的实验数据，提出了抗-O1mAb的治疗用途。抗LPSO-抗原的抗体，特别是抗O1抗原(半乳聚糖-II)的抗体是以前由其它人开发和测试的。表明这些抗体诱导调理吞噬细胞杀伤(OPK)(1)并且在克雷伯氏菌感染的鼠模型中提供保护(2)。基于调理潜力，意味着使用针对半乳聚糖-II的mAb是有希望的抗菌策略(2；3)。Hsieh等人描述了D-半乳聚糖II作为O1LPS中的免疫显性抗原及其在疫苗设计中的意义(14)。存在用于O1抗原的详细结构分析以及针对该结构的单克隆抗体的现有技术。选择此类现有技术的抗体是基于其调理功能，即功效将依赖于受感染宿主的吞噬细胞功能。但是，肺炎克雷伯氏菌作为机会致病菌倾向于感染免疫功能低下的个体，其吞噬活性可能严重不足(参见上文)。Kubota等人描述了具有改进的效应子功能的工程改造的治疗性抗体，比如抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性(15)。免疫功能低下的患者不能产生正常的免疫应答，导致免疫系统较弱/受损(免疫缺陷)。免疫缺陷可以是原发性的(当遗传缺陷影响免疫细胞时)或继发性的(当因素影响具有本质上正常的免疫系统的宿主导致获得性免疫缺陷时)并且它们可以由抗体、淋巴细胞、吞噬细胞、补体系统的紊乱或这些因素的组合导致。由于肺炎克雷伯氏菌通常导致在医院环境爆发疾病，因此在同一临床病房，与患有肺炎克雷伯氏菌感染患者共用医疗设备或人员的患者的感染风险很高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供改良抗体，所述改良抗体可用于治疗人主体，用于免疫预防和免疫疗法，特别是用于治疗免疫功能低下的患者。所述目的通过本专利技术的主题来解决。根据本专利技术，提供了特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的D-半乳聚糖-II，特别是LPS内的D-半乳聚糖-II表位，或D-半乳聚糖-II抗原的人源化或人单克隆IgG抗体(mAb)，该抗体的特征在于杀菌性CDC活性。特别是，抗体包括含有C1q结合位点的Fc区，其特征在于杀菌性CDC活性。特别是，如本文所述的抗体是特异性识别肺炎克雷伯氏菌O1的D-半乳聚糖-II抗原的mAb，其包括含有C1q结合位点的人恒定区，其特征在于杀细菌CDC活性。特别是，抗体包含IgG1或IgG3抗体的结构，优选包括人IgG1或IgG3的Fc。特别是，抗体是IgG1或IgG3抗体。如本文所用，抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)是其中一种或多种补体蛋白组分识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞裂解的反应。特别是，抗体的特征在于对循环中含有抗原的细菌的补体介导的直接杀死的CDC活性，例如通过标准CDC测定法在血清中测定。特别地，与对照相比，如果细胞溶解的百分比显著增加，则抗体具有杀菌性CDC活性。与CDC有关的细胞毒性活性优选以绝对百分比增加来测量，其优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。令人惊讶的是，尽管肺炎克雷伯氏菌血清型O1对血清杀死有天然抗性，但是多种IgG1型单克隆人抗体(每种具有不同抗原结合位点和不同CDR序列)能够通过CDC活性直接杀死细菌。治疗吞噬缺陷患者或免疫功能低下患者时，杀菌活性尤其重要。特别是，抗体是人源化的(包括例如嵌合mAb比如人/小鼠mAb，或其它人源化mAb比如在CDR移植至人IgG1框架时获得的那些)或人mAb。根据具体实施方案，抗体包括：A特征为以下CDR序列的抗原结合位点：a)由SEQID1的氨基酸序列组成的CDR1；和b)由SEQID2的氨基酸序列组成的CDR2；和c)由SEQID3的氨基酸序列组成的CDR3；和d)由SEQID4的氨基酸序列组成的CDR4；和e)由SEQID5的氨基酸序列组成的CDR5；和f)由SEQID6的氨基酸序列组成的CDR6；或B如A中所定义的抗原结合位点的功能变体，其中所述功能变体包括任何一个或多个CDR序列中的至少一个点突变，并且另外其中i.所述功能变体具有结合gal-II表位的特异性；和/或ii.所述功能变体是人的，人源化的，包括例如人/小鼠嵌合的或亲和力成熟的变体抗原结合位点。特别是，将CDR1-3序列并入抗体重链的可变结构域(VH结构域)，并将CDR4-6序列并入抗体轻链的可变结构域(VL结构域)，采用人VH和VL框本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的D‑半乳聚糖‑II的人或人源化单克隆IgG抗体(mAb)，其特征在于杀菌性CDC活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.16 EP 15190136.01.一种特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的D-半乳聚糖-II的人或人源化单克隆IgG抗体(mAb)，其特征在于杀菌性CDC活性。2.如权利要求1所述的抗体，其为人或人源化的mAb。3.如权利要求1或2所述的抗体，其包含：A抗原结合位点，其特征在于以下CDR序列：a)由SEQID1的氨基酸序列组成的CDR1；和b)由SEQID2的氨基酸序列组成的CDR2；和c)由SEQID3的氨基酸序列组成的CDR3；和d)由SEQID4的氨基酸序列组成的CDR4；和e)由SEQID5的氨基酸序列组成的CDR5；和f)由SEQID6的氨基酸序列组成的CDR6；或B如A中所定义的抗原结合位点的功能变体，其中所述功能变体在任何一个或多个CDR序列中包含至少一个点突变，并且进一步其中i.所述功能变体具有结合gal-II表位的特异性；和/或ii.所述功能变体是抗原结合位点的人、人源化或亲和力成熟的变体。4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其为全长单克隆抗体，其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含至少一个含有抗原结合位点的抗体结构域构造和Fc区，所述融合蛋白至少包含与异源肽或多肽融合的所述抗体片段。5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其包含人IgG1或IgG3的Fc，优选任何人IgG1或IgG3同种异型，优选由氨基酸序列SEQID7识别的人IgG1同种异型G1m1,17的恒定区，或其Fc部分，或其功能变体，其包含C1q结合位点。6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其具有结合所述O1抗原的亲和力，具有小于10-6M，优选小于10-7M或小于10-8M的Kd。7.一种人造单克隆抗体组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体。8.一种药物制剂，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体，优选包含肠胃外或粘膜制剂，任选含有药学上可接受的载体或赋形剂。9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体，其用于治疗有风险患有或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体的感染或改善由所述感染引起的病情，优选用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·纳吉，G·纳吉，V·西亚尔托，L·M·瓜查利亚，I·米尔基娜，Z·维斯拉姆，
申请(专利权)人：阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT