一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法技术

一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法，包括以下步骤：采用毛细玻璃管收集外周血制得测试标准样；将测试标准样置于拉曼光谱仪显微镜下进行测试得到原始拉曼光谱；原始拉曼光谱经平滑、扣基线处理后，把每条拉曼光谱的所有峰值都除以该条光谱中1003 cm‑1或1447 cm‑1或1658 cm‑1处的拉曼强度，处理后所得的数据组成数据库；筛查：数据判别方法为偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)，波数分析范围是600～1800 cm‑1，数值大于等于0.5者为癌变，小于0.5者为正常。本发明专利技术具有易于操作、快速（3分钟内）、价格便宜、灵敏性和特异性高等优点，尤其适用于中国以及太行山地区的食管癌筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法
本专利技术属于食管癌筛查领域，尤其涉及一种外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法。
技术介绍
食管癌是一种常见的恶性癌症，预后差导致病人5年存活率较低。据有文献报道，在临床上检测到II期或者更早期的癌变病人不超过25％。无法在早期检测到食管癌变，是导致其存活率低的主要原因。从组织学结构上来看，主要有两种亚型食管癌：腺癌和鳞状细胞癌。腺癌主要发生在西方较发达国家，鳞状细胞癌则主要集中在发展中国家，特别是我国的太行山地区，是食管鳞癌的高发区。因此，在高发区建立一种快速准确的食管鳞癌筛查方法显得尤为重要。组织活检是检测癌症的“金标准”，其侵入性强、周期长等特点决定其不能作为一种早期筛查方法。常规的CT、MRI检测价格昂贵，且无法检测到早期微小病灶。尽管内镜可以较准确的检测到食管癌，但其成本高、侵入性较强以及较高的心理负担使其也不适合作为一种食管癌筛查方法。人体体液中，特别是外围血液中含有大量的游离循环肿瘤DNA、蛋白、酶、抗体等肿瘤标记物，这些肿瘤标记物生化性质的改变，可以诊断癌症或检测癌症的治疗效果。而且，血液抽取侵入性低、操作方便、价格便宜，非常适合作为筛查方法。流行病学研究已经表明，体内高水平氧化剂和抗氧化剂的缺失可能是由癌前病变为癌症的重要信号。体内氧化剂水平很难检测，但抗氧化剂则比较容易检测。体内比较常见的抗氧化剂是β胡萝卜素，维生素E、维生素C等，已经有众多研究关注这些抗氧化剂以及它们的外周血浓度与癌变的相关性。Blot等人研究表明在膳食中补充维生素和矿物质特别是β胡萝卜素，维生素E和硒能降低中国林县(今安阳林州)地区食管鳞状细胞癌的发生。Smith等人研究表明，相比于正常人，肺癌、食管癌、肠癌、宫颈癌等患者的血清β胡萝卜素含量较低。Gui-LingHuang等人研究表明，血清中高水平的维生素D3和β胡萝卜素可以减小中国人群的食管鳞状细胞癌发病风险。因此，检测血液中β胡萝卜素含量可以判别食管鳞癌潜在发生风险。血液中β胡萝卜素含量常用的检测方法有纸层析法，薄层层析法，柱层分析法，分光光度计法，高效液相色谱法或液质联用法等。这些常规方法大多涉及到对β胡萝卜素进行分离纯化、不能排除其它因素干扰、过程繁琐复杂等缺点。作为一个病理分析手段还比较可行，但作为一种普适性的癌症筛查方法则非常不合适。拉曼光谱技术已经被证实是一种有力的生化分子水平检测手段，具有制样简单(一般样品无需事前处理)、检测时间短(一般不超过20秒即可获得高质量数据)、无侵入(光信号)并可同时获取生物多组分结构信息等优点。基于拉曼光谱技术的血液化学成分检测已经广泛应用于血糖、心理疾病、法医、癌症以及各类疾病等领域。在使用488、514、532nm激光激发时，可以获得比较强的β胡萝卜素共振拉曼峰，拉曼位移主要是在1157和1520cm-1附近两个峰。最近研究中，使用拉曼光谱技术也证实了在口腔癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等癌变病人血液中的β胡萝卜素含量较健康人会减小。因此，我们拟采用532nm激光激发血液，获得拉曼光谱，并基于β胡萝卜素含量去建立快速食管癌筛查方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法。基于上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法，包括以下步骤：1)采用毛细玻璃管收集外周血制得测试标准样；2)显微拉曼光谱测试：测试前，先用硅片的拉曼峰520.7cm-1进行波数校正，再将测试标准样置于拉曼光谱仪显微镜下进行测试得到原始拉曼光谱；3)原始数据处理：原始拉曼光谱经平滑、扣基线处理后，把每条拉曼光谱的所有峰值都除以该条光谱中1003cm-1或1447cm-1或1658cm-1处的拉曼强度，处理后所得的数据组成数据库；4)拉曼光谱数据库：癌症患者和正常人外周血的拉曼光谱分别包含180条以上，该拉曼数据库用于食管癌判别筛查；5)筛查：数据判别方法为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，波数分析范围是600～1800cm-1，数值大于等于0.5者为癌变，小于0.5者为正常。步骤1)中，毛细玻璃管的内径为0.5mm，外径为0.82mm。步骤1)中，外周血为全血、血浆或血清中一种。步骤2)中，测试条件为：50倍或100倍物镜，激光激发波长为532nm、488nm和514nm中的一种，激光功率为100mW，测试波数范围是100～1800cm-1，1800g/mm光栅，-70℃制冷CCD积分时间为15秒两次。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术将激光拉曼光谱应用于临床食管癌筛查中，样本获取简单，毛细玻璃管直接测试则提高了拉曼光谱收集效率；以外周血中的β胡萝卜素含量作为肿瘤标记物去获取共振激光拉曼光谱，并在最佳的测试条件下，获得了高质量的拉曼光谱信号，为获得高灵敏度和特异性的判别分析奠定基础；在600-1800cm-1范围内采用PLS-DA进行判别分析，进一步提高了检测灵敏度和特异性。该筛查方法样本采取简单，在3分钟内即可获得检测结果。虽然拉曼光谱仪价格较高，但其维护成本极低，在进行大众筛查时的价格就十分便宜。同时，因为较高的拉曼光谱收集效率和高质量共振拉曼光谱的获得，使其具有较高的灵敏度和特异性高。我们采用PLS-DA进行判别分析时，灵敏度和特异性均可达到100％。此外，因为食管癌的区域性原因，本专利技术适用于中国人群特别是太行山地区的食管癌筛查。附图说明图1为使用毛细玻璃管和传统滴在CaF2玻璃片上获得的拉曼光谱结果对比图；图2为样品处理后拉曼光谱平均曲线和标准差曲线；图3为正常和癌变平均谱对比图；图4为采用LOOCV方法的PLS-DA进行建模分辨结果；图5为采用LOOCV方法的感受性曲线(ROC)。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法，具体步骤如下：1)经过医院道德伦理委员会同意，选择45例食管癌I-II期病人和45例正常人入组研究，建立拉曼光谱数据库。其中病人已经病理科确认，并且无其它并发疾病。其平均年龄为67岁，男性21例，女性24例。正常人无任何疾病，平均年龄为53岁，其中男性28例，女性17例。2)空腹采血后，分别加EDTA、肝素、枸橼酸盐抗凝获得三个血浆样本和分离胶促凝获得血清样本。上述样本均是在采血后6小时内3000转/分钟离心5分钟得到。获得好的样本，可以直接测试，或者放到-70℃冰箱保存，不超过3个月。3)测试前，冷冻样本需要充分化冻后，采用内径为0.5mm，外径为0.82mm的毛细玻璃管抽取后直接放到拉曼光谱仪物镜下测试。使用显微拉曼光谱测试前使用硅片的拉曼峰520.7cm-1进行波数校正。测试时采用100倍物镜，532nm激光激发波长，激光功率为100mW，测试波数范围是100-1800cm-1，1800g/mm光栅，-70℃制冷CCD积分时间为15秒两次。在该测试条件下，使用毛细玻璃管测试，比传统滴在CaF2玻璃片上获得拉曼光谱质量较高(参看附图1)，且滴在CaF2玻璃片容易造成样品浓度变化，测试谱图重复性较差，在毛细玻璃管中则可以避免这个问题。从附图1中可以看到，无论癌变还是正常本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：1）采用毛细玻璃管收集外周血制得测试标准样；2）显微拉曼光谱测试：测试前，先用硅片的拉曼峰520.7 cm‑1进行波数校正，再将测试标准样置于拉曼光谱仪显微镜下进行测试得到原始拉曼光谱;3）原始数据处理：原始拉曼光谱经平滑、扣基线处理后，把每条拉曼光谱的所有峰值都除以该条光谱中1003 cm‑1或1447 cm‑1或1658 cm‑1处的拉曼强度，处理后所得的数据组成数据库；4）拉曼光谱数据库：癌症患者和正常人外周血的拉曼光谱分别包含180条以上，该拉曼数据库用于食管癌判别筛查；5）筛查：数据判别方法为偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)，波数分析范围是600～1800 cm‑1，数值大于等于0.5者为癌变，小于0.5者为正常。

【技术特征摘要】
2018.06.05 CN 20181056807241.一种基于外周血拉曼光谱的快速食管癌筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：1）采用毛细玻璃管收集外周血制得测试标准样；2）显微拉曼光谱测试：测试前，先用硅片的拉曼峰520.7cm-1进行波数校正，再将测试标准样置于拉曼光谱仪显微镜下进行测试得到原始拉曼光谱;3）原始数据处理：原始拉曼光谱经平滑、扣基线处理后，把每条拉曼光谱的所有峰值都除以该条光谱中1003cm-1或1447cm-1或1658cm-1处的拉曼强度，处理后所得的数据组成数据库；4）拉曼光谱数据库：癌症患者和正常人外周血的拉曼光谱分别包含180条以上，该拉曼数据库用于食管癌判别筛查；5）筛查：数据判...

【专利技术属性】
技术研发人员：李现常，张石定，陈红军，周福有，徐瑞平，
申请(专利权)人：安阳工学院，
类型：发明
国别省市：河南,41