检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法技术

本发明专利技术是用液相芯片检测结核分枝杆菌耐药突变位点的引物、探针及方法，其用于检测结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点。其中异烟肼耐药突变位点位于katG基因和inhA基因，利福平耐药突变位点位于rpoB基因,福诺喹酮类药物的耐药突变位点位于gyrA基因。本发明专利技术根据基因库中4种耐药相关基因的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计引物和探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中是否含有耐药突变位点。本发明专利技术提供的耐药基因突变位点的检测，对于临床采取正确的治疗方案来治疗结核分支杆菌的感染至关重要。本发明专利技术具有检测速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，利于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法
本专利技术涉及一种结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药相关基因突变位点的检测，尤其是一种借助液相芯片对结核分枝杆菌针对3种药物耐药相关的基因突变位点的检测，属于医学监测

技术介绍
结核(Tuberculosis，TB)是威胁人类健康的最主要的传染病之一，而结核耐药性的出现是目前结核病治疗过程中面临的最大难题。全球约20亿结核分支杆菌感染者，每年多达130万人死于结核病。近10年来，由于抗生素的广泛使用和不合理使用，导致了多重耐药结核菌株(MDR-TB)以及广泛耐药结核菌株(XDR-TB)的出现，为结核病的防治带来严峻的挑战。耐药结核较敏感结核具有更高的发病率、病死率和传染能力。目前尚未开发出有效治疗耐药结核的新型药物。我国近年来一直是全世界结核病负担第二高的国家，而耐药结核的病例数居世界首位。结核耐药性的检测对结核的临床治疗和防治耐药结核的传播至关重要，也是临床治疗过程中面临的难题。现有基于培养法的药敏试验，一般需要3-4周的时间，而近年发展起来的结核杆菌快速培养和药敏测定也需要1-2周的时间。分子生物学的应用大大提高了结核耐药菌株的检测速度，但是结核杆菌的耐药是由多个基因上多个位点的突变引起的，导致基于PCR的检测方法存在操作繁琐、工作量过大的缺点而难以在临床上推广使用。MASA液相芯片(Multi-AnalyteSuspensionArray，多功能悬浮点阵仪)技术是20世纪90年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起，具有高灵敏性，高异性，高通量，操作简单的特点。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带用不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。检测过程中目的分子能够与偶联在微球上的探针特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，当微球通过Luminex检测仪时，该检测仪上的红色和绿色激光分别对单个微球上的编码荧光和报告分子藻红蛋白进行检测，检测结果通过荧光值直接判读。由于液相芯片具有准确性高，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已被广泛用在细胞因子的检测，激酶的检测，抗原决定簇的筛选，疾病病原体的检测，以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种用液相芯片检测结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药相关的基因突变位点检测的引物和探针，还提供一种利用上述引物和探针检测结核分枝杆菌针对上述3种药物耐药的基因突变位点检测的方法。本专利技术解决其技术问题采用以下的技术方案：本专利技术提供的是一种基于MASA液相芯片对结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点检测的引物。这3种结核分枝杆菌治疗药物的耐药位点分别位于4个基因上，其中异烟肼耐药基因位点位于katG基因和inhA基因，利福平耐药基因位点位于rpoB基因,福诺喹酮类药物的耐药基因位点位于gyrA基因。主要根据基因库中能够检索到的4种耐药相关基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：katG-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTAkatG-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC(2)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：inhA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTinhA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC(3)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：rpoB-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGArpoB-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC(4)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：gyrA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACAgyrA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCATTGCCTGGCGAGCCGAAGT本专利技术提供的用液相芯片检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的探针有24种，它们分别与上述的4种引物对应设计制成，所述探针为特异性检测探针，其DNA序列为：(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC的DNA序列：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC(2)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC的DNA序列：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC(3)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C的DNA序列：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG(4)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的突变型探针inhA--15T的DNA序列：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG(5)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的DNA序列：NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC(6)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的探针突变型inhA--8A的DNA序列：NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC(7)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的DNA序列：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG(8)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GTC的DNA序列：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG(9)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GGC的DNA序列：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG(10)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的DNA序列：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG(11)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526TAC的DNA序列：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG(12)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物组，其特征是一种用MASA液相芯片对临床常见的3种结核分枝杆菌治疗药物的耐药相关基因突变位点进行检测的引物组，该引物组引物是根据基因库中能够检索到的目标基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：（1）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：katG‑F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTAkatG‑R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC；（2）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：inhA‑F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTinhA‑R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC；（3）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：rpoB‑F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGArpoB‑R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC；（4）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：gyrA‑F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACAgyrA‑R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCATTGCCTGGCGAGCCGAAGT 。...

【技术特征摘要】
1.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物组，其特征是一种用MASA液相芯片对临床常见的3种结核分枝杆菌治疗药物的耐药相关基因突变位点进行检测的引物组，该引物组引物是根据基因库中能够检索到的目标基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：（1）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：katG-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTAkatG-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC；（2）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：inhA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTinhA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC；（3）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：rpoB-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGArpoB-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC；（4）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：gyrA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACAgyrA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCATTGCCTGGCGAGCCGAAGT。2.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的探针，其特征是一种用MASA液相芯片检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的探针，有24种探针，它们分别与权利要求1所述的4种引物对应设计，具体是：（1）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC；（2）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC；（3）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的野生型探针inhA--15C：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG；（4）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的突变型探针inhA--15T：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG；（5）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA--8T：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC；（6）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的突变型探针inhA--8A：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC；（7）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG；（8）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GTC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG；（9）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GGC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG；（10）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG；（11）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526TAC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG；（12）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526GAC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG；（13）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-531TCG：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCGACAGTCGGCGC；（14）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCAACAGTCGGCGC；（15）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACGCGTCGCCGTGC；（16）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-90GTG：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACACGTCGCCGTGC；（17）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹飞飞，陈福和，吕刚，袁国勇，朱奇轩，符瑞佳，梁培，陈锦龙，
申请(专利权)人：海南医学院，港大科桥有限公司，
类型：发明
国别省市：海南,46