一种高效的hPSCs向MSCs分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效的hPSCs向MSCs分化诱导的方法，其步骤是：1)将未分化hPSCs细胞株转移到细胞外基质包被的培养板上培养后；换用含有BMP‑SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF‑β1/Activin/Nodal‑SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂、PI3K抑制剂的分化培养基培养；2)去除旧培养基，换含有TGF‑β1/Activin/Nodal‑SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；3)将细胞消化并转移到新的培养板上，换含有TGF‑β1/Activin/Nodal‑SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；4)将细胞消化并转移到贴壁用培养板上继续培养，获得MSCs。本发明专利技术在体外建立了完整的hPSC通过中段原条阶段或侧中胚层阶段定向分化为MSCs的方案方法。相较于常规方法，本技术步骤精简，操作简易，再现性高，仅仅用12天便可以获得表型成熟、高质量的MSCs。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的hPSCs向MSCs分化的方法
本专利技术涉及细胞培养领域，特别涉及一种高效的hPSCs向MSCs分化的方法。
技术介绍
作为临床再生医学移植的细胞来源主要包括人多能干细胞(humanpluripotentstemcells，hPSCs)即人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells，hESCs)和人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells，hiPSCs)等的统称以及成体干细胞这两大类，其中成体干细胞包括造血干细胞，间充质干细胞等。来源于中胚层的间充质干细胞最初是由1966年Friedenstein等从老鼠骨髓抽出物中发现存在成纤维细胞样的细胞而且分离鉴定出来的，1991年Caplan最初将这些细胞称为间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)。2006年国际细胞治疗协会(InternationalSocietyforCellularTherapy，ISCT)提议把这些细胞正式命名为‘multipotentmesenchymalstromalcells’或‘mesenchymalstemcells’(MSCs)；并且把MSCs定义为1)可以贴壁生长；2)能向成骨、软骨和脂肪细胞等中胚层谱系分化；3)高水平表达CD105、CD90、CD73等MSCs阳性标志；基本不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19以及HLA-DR等MSCs阴性标志。MSCs除了自我更新，分化成中胚层谱系的肌肉、骨骼、软骨、脂肪、肌腱和韧带，甚至还可以跨胚层转分化为神经、胰岛细胞等多谱系分化和免疫调节的能力，且避免发生肿瘤。根据美国NIH临床试验注册中心ClinicalTrials.gov，2016年临床试验数据库(拥有201个国家的约25万种试验记录)显示～500个临床试验是与MSCs有关，其中有许多临床试验评估了MSC对多种疾病的影响，包括骨关节炎，创面愈合，退行性疾病，自身免疫性疾病等。由此可见MSCs在细胞再生医疗的重要位置。虽然MSCs的来源广泛获取方法众多，临床应用一般是从骨髓、脐带及脂肪组织中分离而获得，但从组织中分离MSCs都会面临低收率、存在混杂细胞以及纯化细胞、获得一个更成熟的表型所需时间较长(约1个多月)容易造成细胞衰老，同种异体的免疫排斥(脐带来源)等问题。所以从临床需求而言，其供体来源短缺依然是必须解决的问题。相比之下，从自体来源或免疫配型匹配并且无限增殖的hiPSCs定向分化衍生而来的MSCs，比从脂肪、脐血、骨髓以及ESCs来源的MSCs能更好地解决这些临床细胞治疗的问题。目前，由hPSCs(hiPSCs和hESCs)分化衍生出MSCs(hPSC-MSCs)最经典的方法是通过小分子化合物SB431542阻碍转化生长因子TGF-β(TransformingGrowthFactor)信号通道中ALK5，4，7激酶，达到抑制SMAD2/3信号的作用。从而降解hiPSCs或hESCs的多能性，诱发上皮向间质转化EMT(Epithelial-to-MesenchymalTransition)的发生，促进hPSC-MSCs，从而获得表型成熟、高质量的hPSC-MSCs。但难免会导致衍生出不需要的细胞谱系。然而干细胞分化到所需的细胞谱系是相当复杂而难以掌控的一个过程，尤其是人胚胎生物学(限于伦理道德)，所以在体外要高度模拟、遵循人胚胎发育期间的生物学原理来研究干细胞定向分化是一份十分艰巨而又非常具有挑战性的科研工作。因此，到目前为止还没有出现过将hPSCs定向分化成高度模拟胚胎期MSCs完整的方案方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种高效的hPSCs向MSCs分化的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种高效的hPSCs向MSCs分化诱导的方法，其步骤是：1)将未分化hPSCs细胞株转移到细胞外基质包被的培养板上培养后；换用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂、PI3K抑制剂的分化培养基培养；2)去除旧培养基，换含有TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；3)将细胞消化并转移到新的培养板上，换含有TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；4)将细胞消化并转移到贴壁用培养板上继续培养，获得MSCs。优选的，步骤3)中，新的培养板是用明胶类细胞外基质包被的，进行细胞筛选。优选的，细胞筛选所得细胞为具有梭型形态特征，表面标志CD90、CD73、CD105为阳性，CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79α或CD19以及HLA-DR为阴性的细胞。优选的，明胶类细胞外基质为细胞培养用明胶或I型、III型、IV型、V型胶原蛋白和弹性蛋白以及层粘连蛋白。优选的，步骤1)中，用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂、PI3K抑制剂的分化培养基培养时间为12～72h。优选的，步骤1)中，BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂BMP2、BMP4、BMP7中的至少一种。优选的，步骤1)中，TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂为ActivinA、ActivinB、TGF-β1、Nodal中的至少一种。优选的，步骤1)中，Wnt激活剂为CHIR99021，BIO、WNT-3a、R-spondin-2中的至少一种。优选的，步骤1)中，PI3K抑制剂为TG100713、PIK90、PI-103中的至少一种。优选的，TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂为SB431542、SB505124、A8301、RepSox中的至少一种。优选的，步骤3)中，继续培养的时间为2～30天。优选的，在步骤2)继续培养之前，先用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt抑制剂的分化培养基培养。优选的，在步骤2)中，继续培养的时间为2～10天。优选的，Wnt抑制剂为Wnt-C59、XAV-939中的至少一种。优选的，步骤4)中继续培养的方法是：用含有间充质干细胞培养基培养。优选的，在步骤1)至步骤4)中，至少一种培养基中含有碱性成纤维细胞生长因子bFGF。优选的，获得的MSCs是使用诱导hPSCs通过中段原条阶段或侧中胚层阶段向MSCs定向分化的方法来获得的。一种MSCs细胞，该细胞由上述分化方法制备而成。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术是世界上首次在体外建立了完整的hPSCs通过中段原条阶段或侧中胚层阶段向MSC定向分化方案方法。为研究来源于人多能干细胞不同细胞的株间差，以及体内外MSCs的差异性提供了可靠的技术资源。2)本专利技术hPSC-MSCs定向分化方案方法，步骤精简，操作简易，再现性高，仅仅用12天便可以获得表型成熟、高质量的来源于中胚层谱系的MSCs。附图说明图1为hiPSCs未分化的细胞。图2为hESC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效的hPSCs向MSCs分化诱导的方法，其步骤是：1)将未分化hPSCs细胞株转移到细胞外基质包被的培养板上培养后；换用含有BMP‑SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF‑β1/Activin/Nodal‑SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂、PI3K抑制剂的分化培养基培养；2)去除旧培养基，换含有TGF‑β1/Activin/Nodal‑SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；3)将细胞消化并转移到新的培养板上，换含有TGF‑β1/Activin/Nodal‑SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；4)将细胞消化并转移到贴壁用培养板上继续培养，获得MSCs。

【技术特征摘要】
1.一种高效的hPSCs向MSCs分化诱导的方法，其步骤是：1)将未分化hPSCs细胞株转移到细胞外基质包被的培养板上培养后；换用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂、PI3K抑制剂的分化培养基培养；2)去除旧培养基，换含有TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；3)将细胞消化并转移到新的培养板上，换含有TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；4)将细胞消化并转移到贴壁用培养板上继续培养，获得MSCs。2.根据权利要求1所述的分化诱导的方法，其特征在于，步骤3)中，新的培养板是用明胶类细胞外基质包被的，进行细胞筛选。3.根据权利要求2所述的分化方法，其特征在于，细胞筛选所得细胞为具有梭型形态特征，表面标志CD90、CD73、CD105为阳性，CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79α或CD19以及HLA-DR为阴性的细胞。4.根据权利要求2所述的分化方法，其特征在于，明胶类细胞外基质为细胞培养用明胶或I型、III型、IV型、V型胶原蛋白和弹性蛋白以及层粘连蛋白。5.根据权利要求1所述的分化方法，其特征在于，步骤1)中，用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂、PI3K抑制剂的分化培养基培养时间为12～72h。6.根据权利要求1所述的分化方法，其特征在于，步骤1)中，BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂BMP2、BMP4、BMP7中的至少一种。7.根据权利要求1所述的分化方法，其特征在于，步骤1)中，TGF-β1/Activin/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，李强，陈月花，莫健，
申请(专利权)人：皓昇莱生物制药有限公司，王淋立，
类型：发明
国别省市：广东,44