一种提高硒蛋白TrxR表达的方法技术

一种提高硒蛋白TrxR表达的方法，属于蛋白原核表达技术领域。在TrxR的原核表达过程中，首先在37℃、220rpm条件下培养表达菌株至对数生长末期。然后向培养基中加入L‑半胱氨酸、亚硒酸钠、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和Mn2+、Ca2+、Mg2+等二价金属离子，转入24℃、220rpm诱导表达24小时。Mn2+、Ca2+、Mg2+等二价金属离子的添加提高了TrxR的表达。本发明专利技术方法简便、原料易得、成本低廉，明显的提高了TrxR的表达，具有较高的利用价值。

A method to improve the expression of selenoprotein TrxR

A method for improving the expression of selenoprotein TrxR belongs to the field of prokaryotic expression technology. During the prokaryotic expression of TrxR, the strain was first cultured at 37 C and 220 RPM until the end of logarithmic growth. Then L_cysteine, sodium selenite, isopropylthioglucoside (IPTG) and Mn2+, Ca2+, Mg2+ were added to the medium, and the expression was induced at 24 C and 220 rpm for 24 hours. The addition of two valence metal ions such as Mn2+, Ca2+ and Mg2+ increased the expression of TrxR. The method is simple, the raw material is easy to obtain, the cost is low, the expression of TrxR is obviously improved, and the utility value is high.

【技术实现步骤摘要】
一种提高硒蛋白TrxR表达的方法
本专利技术属于蛋白原核表达
，提供一种提高硒蛋白TrxR表达的方法。
技术介绍
哺乳动物硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase,TrxR)是一类非常重要的硒蛋白。TrxR通过调控硫氧还蛋白(Trx)活性和氧化还原状态来调控细胞增殖、活性和凋亡，与肿瘤等疾病发病机制密切相关，维持着生物体的氧化还原平衡。其中分布最广的是位于细胞质和细胞核的TrxR。对于硒蛋白的表达，Rengby等获得硒蛋白生物合成的“2.4/24/24”表达方法，在对数末期(OD600nm＝2.4)加入诱导剂IPTG，24℃诱导表达24h后收获菌体，已经成为硒蛋白表达的规范(RengbyO,JohanssonL,CarlsonLA,etal.AssessmentofProductionConditionsforEfficientUseofEscherichiacoliinHigh-YieldHeterologousRecombinantSelenoproteinSynthesis[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2004,70(9):5159-5167.)。史金铭等构建了含硒GST融合表达系统，借助大肠杆菌BL21进行表达，每升大肠杆菌发酵液中能得到0.924mg含硒GST融合蛋白(史金铭.含硒谷胱甘肽硫转移酶在大肠杆菌中的表达[D].吉林大学,2004.)。现有硒蛋白的表达方法普遍存在表达量不高的问题，极大的影响了后续硒蛋白的分离纯化，限制了对硒蛋白的进一步研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种提高硒蛋白TrxR表达的方法。本专利技术的技术方案为：一种提高硒蛋白TrxR表达的方法，包括以下步骤：(1)培养菌种将可以表达TrxR的甘油菌保平板划线，置于37℃恒温培养箱里培养，挑取平板上长出的单菌落转入到少量rich型LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中四环素的终浓度为15μg/ml，卡那霉素的终浓度为50μg/ml，氯霉素的终浓度为34μg/ml。使用摇床在37℃、220rpm的条件下摇菌10-14小时。(2)大量培养表达菌株在玻璃摇瓶中装入适量体积的rich型LB培养基，按照2％的比例接入事先培养好的表达菌种，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中三种抗生素终浓度分别为15μg/ml、50μg/ml和34μg/ml，使用摇床在37℃、220rpm的条件下培养8-10小时至对数生长末期，此时表达菌液的OD600nm约为3.6。(3)低温诱导表达TrxR在对数生长末期时，向LB培养基中加入二价金属离子Mn2+、Ca2+或Mg2+中的任一一种、异丙基硫代半乳糖苷IPTG、亚硒酸钠selenite、L-半胱氨酸L-cysteine，在24℃、220rpm条件下低温诱导表达24h；加入二价金属离子可以提高TrxR表达。所述步骤(3)中向LB培养基加入IPTG、selenite、L-cysteine量分别为：每50ml的LB培养基对应加入50μl的0.5MIPTG，50μl的5mMselenite和50μl的100mg/mlL-cysteine。LB培养基中加入二价金属离子的量为：每50ml的LB培养基对应加入2.5-15μl的1MMn2+使Mn2+终浓度为50-300μM，或每50ml的LB培养基对应加入5-50μl的1MCa2+使Ca2+终浓度为100-1000μM，或每50ml的LB培养基对应加入5-25μl的1MMg2+使Mg2+终浓度为100-500μM。所述步骤(1)中摇菌的时间优选为12小时。所述步骤(2)中玻璃摇瓶中的rich型LB培养基体积为20％。所述步骤(2)中培养时间优选为9小时。所述步骤(3)中加入二价金属离子形式优选为MnCl2、CaCl2和MgCl2。所述步骤(3)中Mn2+的终浓度优选为100μM，此时促进表达效果较好，酶体积活力约提高26％；Ca2+的终浓度优选为400μM，此时促进表达效果较好，酶体积活力约提高44％；Mg2+的终浓度优选为300μM，此时促进表达效果较好，酶体积活力约提高189％。相比现有技术，本专利技术可明显提高硒蛋白TrxR的表达，方法简便，且二价金属离子原料易得、成本低廉。附图说明图1是Mn2+Ca2+和Mg2+提高硒蛋白TrxR表达。具体实施方式结合实施例详细阐述本专利技术的具体实施方式如下：实施例1使用250ml玻璃三角摇瓶实验，加入50mlLB培养基，50μl的15mg/ml四环素，50μl的50mg/ml卡那霉素和50μl的34mg/ml氯霉素，1ml接菌量。使用摇床在37℃、220rpm条件下培养至对数生长末期，添加50μl的0.5MIPTG、50μl的5mMselenite、50μl的100mg/mlL-cysteine和2.5-15μl的1MMnCl2，然后24℃低温诱导表达24h。取出1ml菌液，离心弃上清，加入50μlTEbuffer，1μl1mg/ml溶菌酶，反复冻融3次，使细菌破碎蛋白溶出，13,000rpm高速离心10min，收集上清即为含有TrxR的粗酶液。使用DTNB法测试活力，以酶体积活力为指标，发现Mn2+在一定的浓度范围内可以促进TrxR的表达。当Mn2+的浓度为100μM时，促进表达的效果较好，酶体积活力提高26％。实施例2使用250ml玻璃三角摇瓶实验，加入50mlLB培养基，50μl的15mg/ml四环素，50μl的50mg/ml卡那霉素和50μl的34mg/ml氯霉素，1ml接菌量。使用摇床在37℃、220rpm条件下培养至对数生长末期，添加50μl的0.5MIPTG、50μl的5mMselenite、50μl的100mg/mlL-cysteine和5-50μl的1MCaCl2，然后24℃低温诱导表达24h。取出1ml菌液，离心弃上清，加入50μlTEbuffer，1μl1mg/ml溶菌酶，反复冻融3次，使细菌破碎蛋白溶出，13,000rpm高速离心10min，收集上清即为含有TrxR的粗酶液。使用DTNB法测试活力，以酶体积活力为指标，发现Ca2+在一定的浓度范围内可以促进TrxR的表达。当Ca2+的浓度为400μM时，促进表达的效果较好，酶体积活力约提高44％。实施例3使用250ml玻璃三角摇瓶实验，加入50mlLB培养基，50μl的15mg/ml四环素，50μl的50mg/ml卡那霉素和50μl的34mg/ml氯霉素，1ml接菌量。使用摇床在37℃、220rpm条件下培养至对数生长末期，添加50μl的0.5MIPTG、50μl的5mMselenite、50μl的100mg/mlL-cysteine和5-25μl的1MMgCl2，然后24℃低温诱导表达24h。取出1ml菌液，离心弃上清，加入50μlTEbuffer，1μl1mg/ml溶菌酶，反复冻融3次，使细菌破碎蛋白溶出，13,000rpm高速离心10min，收集上清即为含有TrxR的粗酶液。使用DTNB法测试活力，以酶体积活力为指标，发现Mg2+在一定的浓度范围内可以促进TrxR的表达。当Mg2+的浓度为300μM时，促进表达的效果较本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高硒蛋白TrxR表达的方法，其特征在于以下步骤：(1)培养菌种将可以表达TrxR的甘油菌保平板划线，置于37℃恒温培养箱里培养，挑取平板上长出的单菌落转入rich型LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中四环素的终浓度为15μg/ml，卡那霉素的终浓度为50μg/ml，氯霉素的终浓度为34μg/ml；使用摇床在37℃、220rpm的条件下摇菌10‑14小时；(2)大量培养表达菌株在玻璃摇瓶中装入rich型LB培养基，按照2％的比例接入事先培养好的表达菌种，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中三种抗生素终浓度分别为15μg/ml、50μg/ml和34μg/ml，使用摇床在37℃、220rpm的条件下培养8‑10小时至对数生长末期；(3)低温诱导表达TrxR在对数生长末期时，向LB培养基中加入二价金属离子Mn2+、Ca2+或Mg2+中的任一一种、异丙基硫代半乳糖苷IPTG、亚硒酸钠selenite、L‑半胱氨酸L‑cysteine，在24℃、220rpm条件下低温诱导表达24h；LB培养基加入IPTG、selenite、L‑cysteine量分别为：每50ml的LB培养基对应加入50μl的0.5M IPTG，50μl的5mM selenite和50μl的100mg/ml L‑cysteine；LB培养基中加入二价金属离子的量为：每50ml的LB培养基对应加入2.5‑15μl的1M Mn2+使Mn2+终浓度为50‑300μM，或每50ml的LB培养基对应加入5‑50μl的1M Ca2+使Ca2+终浓度为100‑1000μM，或每50ml的LB培养基对应加入5‑25μl的1M Mg2+使Mg2+终浓度为100‑500μM。...

【技术特征摘要】
1.一种提高硒蛋白TrxR表达的方法，其特征在于以下步骤：(1)培养菌种将可以表达TrxR的甘油菌保平板划线，置于37℃恒温培养箱里培养，挑取平板上长出的单菌落转入rich型LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中四环素的终浓度为15μg/ml，卡那霉素的终浓度为50μg/ml，氯霉素的终浓度为34μg/ml；使用摇床在37℃、220rpm的条件下摇菌10-14小时；(2)大量培养表达菌株在玻璃摇瓶中装入rich型LB培养基，按照2％的比例接入事先培养好的表达菌种，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中三种抗生素终浓度分别为15μg/ml、50μg/ml和34μg/ml，使用摇床在37℃、220rpm的条件下培养8-10小时至对数生长末期；(3)低温诱导表达TrxR在对数生长末期时，向LB培养基中加入二价金属离子Mn2+、Ca2+或Mg2+中的任一一种、异丙基硫代半乳糖苷IPTG、亚硒酸钠selenite、L-半胱氨酸L-cysteine，在24℃、220rpm条件下低温诱导表达24h；LB培养基加入IPTG、selenite、L-cysteine量分别为：每50ml的LB培养基对应加入50μl的0.5MIPTG，50μl的5mMselenite和50μl的100mg/mlL-cysteine；LB培养基中加入二价金属离子的量为：每50ml的LB培养基对应加入2.5-15μl的1MMn2+使Mn2+终浓度为50-300μM...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建强，张竞争，徐卫平，孙世博，关水，马昆，薛宏宇，王晓晓，张楠，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21