一种狂犬病毒颗粒的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种狂犬病毒颗粒的纯化方法，包括将病毒液进行次序可互换的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。本发明专利技术方法的有益效果在于：狂犬病毒液的前处理工艺要求低，不会对狂犬病毒颗粒造成二次破坏，可以在不调整工艺条件的情况下，处理各种培养基质培养得到的病毒液，处理量大，处理成本低；提高了狂犬病毒颗粒的结构均一性，通过离子交换层析和羟基磷灰石层析，可将目标病毒颗粒与分子量接近但结构异常的病毒颗粒有效分离。

【技术实现步骤摘要】
一种狂犬病毒颗粒的纯化方法
本专利技术属于病毒生物学
，具体涉及一种狂犬病毒颗粒的纯化方法。
技术介绍
狂犬病毒是一种包膜病毒，结构复杂且变化较大，因此，获得纯度高、结构均质的狂犬病毒颗粒非常困难。狂犬病毒颗粒由一条单链RNA分子(约11930个核苷酸)和5种蛋白质构成，其中，20～150个L蛋白、950个P蛋白和单链RNA组成结构稳定的核衣壳，核衣壳外包裹来源于宿主细胞的双层脂质膜，核衣壳与脂质膜之间添充了1650个M蛋白；脂质膜表面插入了不同数量的G蛋白，G蛋白上连接了不同数量和不同长度的糖链。G蛋白的数量和糖基化程度对病毒颗粒的生物学特性和免疫学特性具有重大影响。目前狂犬病毒培养所用培养基质包括小鼠脑、鸡胚、鸭胚、地鼠肾原代细胞、鸡胚原代成纤维细胞病毒、人二倍体细胞和Vero细胞等，无论使用何种培养基质，狂犬病毒收获液都是一个成分复杂的混合物体系。其包括各种结构的狂犬病毒颗粒及各种杂质。完整的狂犬病毒颗粒大小约75×180nm，分子量5～8×108，沉降系数600S，在蔗糖溶液中的浮力密度1.14～1.17g/ml。脱落细胞直经约5μm，大部分细胞碎片直经在0.8μm以上，均明显大于病毒颗粒；大部分宿主细胞蛋白质、糖类、脂类和RNA(主要是tRNA和rRNA)分子量在1000KD以下，均明显小于病毒颗粒(mRNA分子量较大，但极不稳定，在收获液中含量微少)；宿主细胞DNA则包含了大于、小于和相当于病毒颗粒大小的系列组分；产品相关杂质也是大小不均的系列组分，包括大于(病毒聚团)、小于(病毒裂解、破碎、未装配成病毒颗粒的亚单位大分子)及相当于有效成分大小(病毒颗粒大小接近但G蛋白拷贝数低、糖基化异常，免疫原性低，故一般列为杂质)的各种成分。目前，狂犬病毒的分离原理主要是利用分子量大小差异将病毒颗粒和杂质分离。分离技术路线主要包括：密度梯度超速离心纯化技术和凝胶过滤柱层析纯化技术。由于病毒收获液中部分大分子杂质的分子筛性质与有效成分非常接近，单纯依靠分子筛原理很难进行有效分离。这类杂质包括：(1)来源于宿主细胞的高分子量蛋白质。培养过程中宿主细胞表达的蛋白质数量在2万种以上，分子量大小不均，许多蛋白质以多聚体形式存在。因此，病毒收获液中的宿主细胞蛋白质(HCP)是一个组成复杂的混合物，其中包括分子筛性质与病毒粒子接近的组分。(2)来源于宿主细胞的DNA。病毒收获液中游离的DNA是通过宿主细胞的破碎、病变、坏死或凋亡产生的，这些细胞生物学过程都会产生基因组DNA被剪切成大小不同片段的结果。因此，病毒收获液中的宿主细胞DNA也是一个分子量大小高度不均一的混合物。一些工艺步骤如超滤浓缩产生的剪切效应还会进一步增加DNA分子量大小的不均一性。一部分DNA组分的分子筛性质与病毒粒子非常相近。(3)来源于培养基添加物如牛血清，牛血清也是一种成分复杂的混合物。(4)来源于狂犬病毒的结构衍生物。病毒培养过程中，通常会产生一部分结构不完整的病毒粒子，如G蛋白拷贝数过低、糖基化缺失或不完全的病毒。这些结构不完整的病毒粒子与结构完整的病毒粒子在生物学性质和免疫学性质等方面有显著差别，但其分子筛性质与结构正常的病毒粒子十分接近，不易分离。基于以上原因，现有的狂犬病毒颗粒纯化方法很难将狂犬病毒颗粒和其他杂质有效分离，更难做到将结构不同或异常的狂犬病毒颗粒分离。此外，现有的纯化方法通常需要对病毒液进行超滤浓缩，而狂犬病毒的膜外蛋白非常脆弱，在超滤浓缩过程中很容易被破坏，导致狂犬病毒颗粒的异质性更为严重。现有的纯化工艺对培养得到的狂犬病毒液要求比较高，只能用于处理特定方法培养的狂犬病毒液，一旦培养方法改变，则纯化工艺需要进行大范围的改变。即便针对同一方法培养得到的狂犬病毒液进行纯化，也很难保证产品批次间的稳定性，无法获得质量高度稳定的狂犬病毒颗粒。因此，开发一种纯化技术路线简洁、分离效率高、分离选择性好、对狂犬病毒结构破坏性小的狂犬病毒纯化方法具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种狂犬病毒颗粒的纯化方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于狂犬病毒颗粒的纯化方法，包括将狂犬病毒病毒液进行阴离子交换层析和羟基磷灰石层析操作，其中，阴离子交换层析在羟基磷灰石层析之前进行；或阴离子交换层析在羟基磷灰石层析之后进行。作为上述方法的进一步改进，阴离子交换层析包括：可选的预平衡操作：包括使用离子交换预平衡液对阴离子交换层析柱进行预平衡；上样操作：将病毒液或经过羟基磷灰石层析后的样液上样至阴离子交换层析柱；可选的平衡操作：包括使用离子交换平衡液对阴离子交换层析柱进行平衡；可选的预洗脱操作：包括使用离子交换预洗脱液对阴离子交换层析柱进行预洗脱；洗脱操作：使用离子交换洗脱液对阴离子交换层析柱进行洗脱。作为上述方法的进一步改进，进一步包括使用第二离子交换洗脱液对阴离子交换层析柱进行洗脱。作为上述方法的进一步改进，分别收集洗出的第一离子交换洗脱液和第二离子交换洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。作为上述方法的进一步改进，羟基磷灰石层析包括：可选的预平衡操作：包括使用羟基磷灰石预平衡液对羟基磷灰石层析柱进行预平衡；上样操作：将病毒液或经过阴离子交换层析后的样液上样至羟基磷灰石层析柱；可选的平衡操作：包括使用羟基磷灰石平衡液对羟基磷灰石层析柱进行平衡；可选的预洗脱操作：包括使用羟基磷灰石预洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行预洗脱；洗脱操作：使用羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。作为上述方法的进一步改进，进一步包括使用第二羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。作为上述方法的进一步改进，分别收集洗出的第一羟基磷灰石洗脱液和第二羟基磷灰石洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。作为上述方法的进一步改进，阴离子交换层析和羟基磷灰石层析之间没有中间层析操作。作为上述方法的进一步改进，阴离子交换层析和羟基磷灰石层析之间没有中间操作。作为上述方法的进一步改进，离子交换层析离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液的pH独立为7.0～9.5。作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液独立为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Tricine缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、TEA缓冲液、巴比妥钠缓冲液。作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液为磷酸缓冲液。作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液独立添加有水溶性盐。一种狂犬病毒颗粒组分，其由上述的方法制备得到。一种狂犬病毒颗粒组分，由以上所述的方法制备得到。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术方法中，狂犬病毒液的前处理工艺要求低，处理条件温和，不会对狂犬病毒颗粒造成二次破坏，同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于狂犬病毒颗粒的纯化方法，包括将狂犬病毒病毒液进行阴离子交换层析和羟基磷灰石层析操作，其中，阴离子交换层析在羟基磷灰石层析之前进行；或阴离子交换层析在羟基磷灰石层析之后进行。

【技术特征摘要】
2017.03.06 CN 2017101394979;2017.03.06 CN 201710131.一种用于狂犬病毒颗粒的纯化方法，包括将狂犬病毒病毒液进行阴离子交换层析和羟基磷灰石层析操作，其中，阴离子交换层析在羟基磷灰石层析之前进行；或阴离子交换层析在羟基磷灰石层析之后进行。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子交换层析包括：可选的预平衡操作：包括使用离子交换预平衡液对阴离子交换层析柱进行预平衡；上样操作：将病毒液或经过羟基磷灰石层析后的样液上样至阴离子交换层析柱；可选的平衡操作：包括使用离子交换平衡液对阴离子交换层析柱进行平衡；可选的预洗脱操作：包括使用离子交换预洗脱液对阴离子交换层析柱进行预洗脱；洗脱操作：使用离子交换洗脱液对阴离子交换层析柱进行洗脱。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括使用第二离子交换洗脱液对阴离子交换层析柱进行洗脱。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，分别收集洗出的第一离子交换洗脱液和第二离子交换洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，羟基磷灰石层析包括：可选的预平衡操作：包括使用羟基磷灰石预平衡液对羟基磷灰石层析柱进行预平衡；上样操作：将病毒液或经过阴离子交换层析后的样液上样至羟基磷灰石层析柱；可选的平衡操作：包括使用羟基磷灰石平衡液对羟基磷灰石层析柱进行平衡；可选的预洗脱操作：包括使用羟基磷灰石预洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行预洗脱；洗脱操作：使用羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。6.根据权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广州瑞贝斯药业有限公司，广州银河阳光生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44