一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法技术

本发明专利技术公开了一种L‑亮氨酸的高效液相色谱检测方法，涉及柱色谱法技术领域。色谱条件：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％‑42％:58％；其中，磷酸二氢钾水溶液浓度为0.1‑0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液pH值为4.2±0.02；流动相流速：0.7‑1.0mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃；进行高效液相色谱分析，测定转化液中L‑亮氨酸含量。本发明专利技术方法可快速、准确测定出L‑亮氨酸含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，检测时间短，准确度高，提高了效率。

A method for the detection of L- leucine by high performance liquid chromatography

The invention discloses a high performance liquid chromatographic detection method for L_leucine, which relates to the technical field of column chromatography. Chromatographic conditions: column: amino-bonded silica gel column; mobile phase: potassium dihydrogen phosphate aqueous solution and acetonitrile volume percentage of 37%: 63%42%: 58%; among them, potassium dihydrogen phosphate aqueous solution concentration is 0.1_0.2 mol/L, potassium dihydrogen phosphate aqueous solution contains ammonia, ammonia accounted for 0.5 vt% of potassium dihydrogen phosphate aqueous solution, phosphoric acid. The pH value of aqueous solution of potassium dihydrogen was 4.2+0.02; the flow rate of mobile phase was 0.7_1.0 mL/min; the detection wavelength was 210 nm; the column temperature was 30; and the content of L-leucine in the conversion solution was determined by high performance liquid chromatography. The method of the invention can quickly and accurately determine the content of L_leucine, ensure its quality controllable, reduce error, save cost, operate simply, test time short, accuracy high, and improve efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法
本专利技术涉及柱色谱法
，尤其涉及一种L-亮氨酸的高效液相检测方法。
技术介绍
酮亮氨酸钙在体内利用非必需氨基酸的氮转化为亮氨酸而发挥作用。亮氨酸为人体8种必需氨基酸之一，属于支链氨基酸。L-亮氨酸是复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对于维持危重病人的营养需要，抢救患者的生命起着积极的作用。同时作为支链氨基酸，因其氧化速率较快，在体内分解产生ATP的效率高于其它氨基酸，从而用来补充大运动量引起的能量消耗，减轻由此引起的中枢神经系统的疲劳反应，减少高强度运动造成的蛋白分解。L-亮氨酸是制备酮亮氨酸钙的起始原料，由于生产前需对原料药进行质量检测。现有技术中公开了采用C18色谱柱，0.01mmol/L磷酸二氢钾：乙腈、甲醇混合的流动相，在线衍生的方法，但该方法检测时间长，一个样品需35min，且需梯度洗脱，对高效液相色谱仪、配制流动相的试剂要求较高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，该方法可快速，准确测定出L-亮氨酸的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，检测时间短，准确度高，提高了效率。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法：色谱条件为：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％-42％:58％；其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；流动相流速：0.7-1.0mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃；检测步骤为：(1)配制流动相，过滤，脱气；(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取L-亮氨酸对照品和L-亮氨酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得；(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算L-亮氨酸的含量。优选的，流动相流速为0.7mL/min。优选的，流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为40％:60％；磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L。优选的，步骤(3)中，对照品溶液的浓度为0.4mg/mL。优选的，步骤(3)中，供试品溶液的配制为：含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml，用流动相溶解并稀释至50ml。优选的，色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。优选的，步骤(4)中，对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：(1)本专利技术方法可快速，准确测定出L-亮氨酸的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，出峰时间快，缩短生产过程中的检测时间，9min即可检测完成(现有方法需35min)，准确度高，大大提高了生产效率。(2)本专利技术方法可通过一次高效液相检测，准确测定出转化液中L-亮氨酸的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；图1是本专利技术实施例中L-亮氨酸对照品溶液的色谱图；图2是本专利技术实施例2中L-亮氨酸供试品溶液的色谱图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，步骤如下：步骤1、L-亮氨酸对照品溶于流动相中，按比例稀释，分别相当于每1ml中含300μg、400μg、500μg、600μg、700μg的标准溶液；步骤2、采用液相色谱仪分别对不同浓度的标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制L-亮氨酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程为y＝22804x-184098，R2＝0.9997；步骤3、将含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml，用流动相稀释至50ml，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，采用与标准溶液完全相同的测定条件，并记录峰面积，根据步骤2的标准曲线回归方程y＝22804x-184098，R2＝0.9997计算得出所述L-亮氨酸的含量为53.5g/L(外标法测得含量为52.9g/L)。检测方法的检测参数为：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％-42％:58％；其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；流动相流速：0.7-1.0mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃。本专利技术实施例提供的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，可通过一次高效液相检测，准确测定出转化液中L-亮氨酸的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为安捷伦1260和沃特斯2489；色谱柱为岛津氨基键合硅胶柱5μm4.6*250mm；进样体积为20μl(定量环)。也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的氨基键合硅胶柱以及其他进样体积，都能达到本专利技术的目的。实施例1-31.色谱条件：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液与乙腈的体积比为40:60；(其中，磷酸二氢钾水溶液的配制为：取磷酸二氢钾13.61g，加水500ml溶解后加入25～28％的氨水5ml，加水稀释至1000ml，混合均匀后用磷酸调pH值至4.2±0.02)；流动相流速：0.7mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃。2.实验步骤(1)配制流动相，过滤，脱气；(2)调节高效液相色谱仪，平衡色谱柱；(3)对照品溶液和供试品溶液的配制，称取L-亮氨酸对照品20.0mg于50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度；实施例1-3分别吸取不同生产批次含有L-亮氨酸的生物转化液供试品0.5ml至50ml容量瓶，用流动相溶解并稀释至刻度。(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算结果。外标法计算L-亮氨酸生物转化液中L-亮氨酸的含量：X＝C供试品×对照品的稀释倍数＝(C对照品×A供试品/A对照品)×待测样品的稀释倍数；式中：C对照品为对照品溶液中L-亮氨酸的浓度，单位为mg/ml；A对照品为对照品溶液色谱图的峰面积或峰高；A供试品为供试品溶液色谱图的峰面积或峰高；C供试品为供试品溶液中L-亮氨酸的浓度，单位为mg/ml。具体数值见下表所示：3.实施例2供试品溶液色谱图见图2所示：8.177min为L-亮氨酸的峰，其余的为杂峰，L-亮氨酸峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000，且与杂峰分离度良好。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：色谱条件为：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％‑42％:58％；其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1‑0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；流动相流速：0.7‑1.0mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃；检测步骤为：(1)配制流动相，过滤，脱气；(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取L‑亮氨酸对照品和L‑亮氨酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得；(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算L‑亮氨酸的含量。

【技术特征摘要】
1.一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：色谱条件为：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％-42％:58％；其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；流动相流速：0.7-1.0mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃；检测步骤为：(1)配制流动相，过滤，脱气；(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取L-亮氨酸对照品和L-亮氨酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得；(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算L-亮氨酸的含量。2.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，何连顺，李斌水，米造吉，马静，
申请(专利权)人：精晶药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13