本发明专利技术公开了一种用于人牙髓干细胞培养扩增的血清/血浆/血小板替代物，所述替代物包括：（1）5‑羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。使用该替代物培养牙髓干细胞，避免了因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性。此外，使用该体系培养牙髓干细胞，在细胞治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病，以及因细胞治疗引起的人体免疫反应的风险。本发明专利技术的血清/血浆/血小板替代物，不仅适用于人牙髓干细胞培养扩增，也适于其它组织来源间充质干细胞的培养，应用前景广阔。
A serum / plasma substitute for culturing expanded dental pulp stem cells
The invention discloses a serum/plasma/platelet substitute for the culture and amplification of human dental pulp stem cells. The substitute comprises: (1) 5_hydroxytryptamine, (2) fibronectin, (3) prostaglandins, and (4) citric acid or citrate. Using this substitute to culture dental pulp stem cells can avoid the possibility of different properties of mesenchymal stem cells because of different batches of culture systems. In addition, culturing dental pulp stem cells using this system will avoid zoonosis caused by animal serum or plasma and the risk of human immune response to cell therapy. The serum/plasma/platelet substitute of the invention is not only suitable for the culture and expansion of human dental pulp stem cells, but also suitable for the culture of other tissue-derived mesenchymal stem cells, and has broad application prospects.
【技术实现步骤摘要】
一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物
本专利技术属于细胞生物学领域细胞增殖范畴，具体一种用于人牙髓干细胞培养扩增的血清/血浆/血小板替代物，培养包括牙髓干细胞在内的人间充质干细胞培养时，使用的一种胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物，从而达到快速培养扩增人间充质干细胞尤其是牙髓干细胞的目的。
技术介绍
间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）是一种成体干细胞，具有成骨、成脂肪和呈软骨能力。除多向分化能力外，体外培养的MSC尚具有以下功能：（1）基于促血管新生机制的组织修复能力；（2）基于旁分泌机制的免疫调节作用；（3）基于旁分泌及细胞间接触机制的造血支持作用。因此，MSC不但适用于骨和软骨的修复，可用于植物抗宿主病、系统性红斑狼疮等免疫相关疾病的治疗，以及处理因糖尿病及冠心病引起的微小血管阻塞。鉴于此，在美国NIH注册的有关MSC的临床试验已经近800项。在加拿大、新西兰、韩国、日本等国家，政府已经批准MSC作为一个药物，用于移植物抗宿主病、溃疡性结肠炎、骨关节炎、心肌梗塞等疾病的治疗。国内也有研究者将MSC或牙髓干细胞以药物的形式，申报国家食品与药物监督管理局，开展相关的临床试验，有些申请已经获得批准。因此，作为一种细胞药物，MSC包括牙髓干细胞具有广阔的应用前景。研究发现，多种组织或器官中存在MSC，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、牙髓、肌肉、肝脏、心脏等。目前，常用的组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘及牙髓。这些不同组织来源的MSC，常有不同的名称，如脂肪干细胞、胎盘干细胞及牙髓干细胞等，其实，都应属于间充质干细胞的范畴。与脂肪、骨髓、脐带和胎盘等组织不同，一枚牙齿中牙髓含量极少，所含MSC数量极低。另外，我国FDA发布的细胞产品质量指导原则中，建议尽量不使用异种血清（常指胎牛血清）扩增细胞。因此，将牙髓干细胞应用于临床，尤其是以药物形式用于临床，首先要解决的是培养扩增的问题。培养扩增牙髓干细胞必然面对两个难题：（1）培养扩增时宜选用无血清培养基；（2）使用这种培养基在大量扩增牙髓干细胞的同时，要维系细胞的“干性”（stemness）。为避免异种血清引起的人畜共患病及免疫反应等问题，有人提出使用浓缩人血小板替代牛血清，用于牙髓干细胞的培养，并获得了满意的效果，获得的干细胞数量是使用相同浓度胎牛血清培养所获得细胞数量的2倍（GovindasamyV,etal.Humanplateletlysatepermitsscale-upofdentalpulpstromalcellsforclinicalapplications.Cytotherapy,2011;13:1221-33）。然而，浓缩血小板是一种血液制品，在没有灭活病毒的情况下，仍然有传播传染病的风险；而常规的灭活程序，如白蛋白制备程序，60℃孵育12小时，常使多种细胞因子失活，使浓缩血小板丧失了支持细胞增殖的能力。另外，血小板个体来源不同，其作用能否保证稳定，亦即，能否保障所获得MSC的批次间稳定性等，也是必须考虑的问题。因此，利用一种化学成分清楚、无血清成分的培养基培养扩增牙髓MSC，对治疗的安全性和有效性，都是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术之目的在于提供一种胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物，从而配制一种或几种无血清、化学成分清晰的培养基，适用于培养间充质干细胞，尤其是牙髓来源的间充质干细胞。为解决上述技术问题，本专利技术采取的方案如下。一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，（1）5-羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。所述的5-羟色胺类物质为五羟色胺、3-(2-氨乙酸)吲哚、3-(2-氨乙酸)吲哚马来酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚草酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚盐酸盐或N-乙酰五羟色胺中的一种，用量范围为0.01-100μM。最优用量范围为0.2-1μM。所述玻连蛋白为天然玻连蛋白或其重组活性片段，用量范围为0.1-100mg/L。最优用量范围为1-10mg/L。所述的前列腺素类物质为前列腺素E-1或前列腺素E-2，用量范围为0.5-500ng/ml，最优用量范围为10-100ng/ml。所述的柠檬酸或柠檬酸盐，用量范围为5-600mg/L，最优用量范围为10-50mg/L。包含所述的血清/血浆替代物的培养基，用于牙髓干细胞或其他充质干细胞培养扩增。本专利技术的优点在于：浓缩人血小板作为胎牛血清的替代物，可以快速培养扩增间充质干细胞（包括牙髓干细胞），但是，其化学成分不确定（chemically-undefined），且有传播传染病的风险。那么，能否选择浓缩血小板中支持间充质干细胞增殖的关键成分，用于间充质干细胞尤其是牙髓干细胞的扩增呢。基于该创新思路，我们提供了一种化学成分清晰（chemically-defined）且不含天然蛋白质分子的人血小板替代物，用于间充质干细胞，尤其是人牙髓干细胞的体外培养。本专利技术所提供的胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物（简称替代物），不仅成分明确，且不含动物或人血清或血浆，不含天然的动物血清或血浆中的蛋白质分子。使用该培养基培养牙髓干细胞，细胞增殖速度快，且维系了细胞的干性。所获得的干细胞，不可能被血清或血浆携带的病原体污染，避免了传染病的传播，以及因异种蛋白引起的免疫反应。因此，该培养基用于包括牙髓干细胞在内的间充质干细胞培养扩增，是细胞治疗应用于临床的安全性有效保障，具有重要的应用价值。附图说明图1.不同培养基培养的原代人牙髓干细胞的形态；将消化后的牙髓分别接种于含10%小牛血清的alpha-MEM（A），或含替代物的无血清培养基（B）中，一周后出现贴壁细胞，呈集落样生长。标示：100μm。图2.不同培养基培养的人牙髓干细胞表型分析结果；Control：阴性对照。A：10%小牛血清-alpha-MEM培养的细胞；B：含血小板替代物的无血清培养基培养的细胞。纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度。图中所提供的百分比代表相对阳性细胞数。图3.不同培养体系人牙髓干细胞增殖特点；无血清：为含替代物的无血清培养基。10%BS为含10%小牛血清的alpha-MEM。纵坐标：细胞数，×105个。横坐标：P0-P5分别代表原代（P0）至第五代（P5）的细胞。图4.不同培养体系培养的人牙髓干细胞体外成骨能力；10%血清为含10%小牛血清的alpha-MEM。无血清为含替代物的无血清培养基。标示：100μm。具体实施方式本专利技术提供一种用于培养扩增牙髓干细胞的替代物，替代胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆。使用该替代物配制的培养基组成包括：（1）已经商业化的基础培养基，如alpha-MEM，低糖DMEM，DMEM/F12或几种基础培养基的组合。这些培养基或其组合均可以用于人MSC的培养，不在本专利技术保护范畴。（2）无血清培养基必需包含的物质，如胰岛素、转铁蛋白、激素、脂类物质、维生素、白蛋白、氨基酸、微量元素等。这些物质已经应用于包括间充质干细胞在内的多种细胞的无血清培养，是常见人细胞无血清培养必需的成分。这些成分及其组合不在本专利技术保护范畴之内。（3）人间充质干细胞增殖必需本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述替代物包括：（1）5‑羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。
【技术特征摘要】
1.一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述替代物包括：（1）5-羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。2.根据权利要求1所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述的5-羟色胺类物质为五羟色胺、3-(2-氨乙酸)吲哚、3-(2-氨乙酸)吲哚马来酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚草酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚盐酸盐或N-乙酰五羟色胺中的一种，用量范围为0.01-100μM。3.根据权利要求2所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述的5-羟色胺类物质的用量范围为0.2-1μM。4.根据权利要求1所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述玻连蛋白为天然玻连蛋白或其重组活性片段，用量范围为0.1-100mg/L。5.根据权利要求4所述的一种用于培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭子宽，朱笑飞，
申请(专利权)人：郭子宽，福建省海西细胞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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