用于治疗杜氏肌营养不良症的材料和方法技术

本申请提供了用于离体和在体内治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的材料和方法。另外，本申请提供了通过基因组编辑来编辑细胞中的肌营养不良蛋白基因的材料和方法。

Materials and methods for the treatment of Duchenne muscular dystrophy

The present application provides materials and methods for in vitro and in vivo treatment of patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD). In addition, the present application provides materials and methods for editing dystrophin genes in cells by genome editing.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗杜氏肌营养不良症的材料和方法
本申请提供了用于离体和在体内治疗杜氏肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy，DMD)患者的材料和方法。另外，本申请提供了通过基因组编辑来编辑细胞中的肌营养不良蛋白基因的材料和方法。相关申请本申请要求2015年10月28日递交的美国临时申请No.62/247,484和2016年4月18日递交的美国临时申请No.62/324,064的权益，这两个申请通过引用整体并入本文。通过引用并入序列表本申请包含计算机可读形式的序列表(文件名：160101PCT序列表_ST25：286,928,896字节-ASCII文本文件；2016年10月28日生成)，其通过引用整体并入本文并形成本公开的一部分。背景杜氏肌营养不良症(DMD)是一种严重的X连锁隐性神经肌肉障碍，约在4000名活的男新生儿中产生1例。患者通常在4岁之前被诊断出，并且在10岁之前就依赖于轮椅。大多数患者由于心脏和/或呼吸衰竭而不能活到25岁以上。现有的治疗充其量是姑息治疗。DMD的最常见治疗是类固醇，其用于减缓肌肉力量的丧失。然而，因为大多数DMD患者在生命早期开始接受类固醇，所以治疗延迟了青春期，并进一步促使患者的生活质量下降。DMD由肌营养不良蛋白(dystrophin)基因(染色体X：31,117,228-33,344,609(基因组参考联盟–GRCh38/hg38))中的突变引起。由于基因组区域长度超过2.2百万碱基，所以肌营养不良蛋白基因是第二大人类基因。肌营养不良蛋白基因含有79个外显子，这些外显子被加工成11000个碱基对的mRNA，所述mRNA被翻译成427kDa的蛋白质。在功能上，肌营养不良蛋白充当肌动蛋白微丝和肌纤维内的细胞外基质之间的接头。肌营养不良蛋白的N末端是肌动蛋白结合结构域，而C末端与跨膜支架相互作用，所述跨膜支架将肌纤维锚定到细胞外基质。在肌肉收缩时，肌营养不良蛋白提供结构支撑，从而允许肌肉组织承受机械力。DMD由肌营养不良蛋白基因内的多种突变引起，所述突变导致提前的终止密码子和因此截短的肌营养不良蛋白。截短的肌营养不良蛋白不含C末端，因此不能提供承受肌肉收缩应力所必需的结构支撑。因此，肌肉纤维自身撕裂，从而导致肌肉萎缩。与DMD相比，贝克型肌营养不良症(BeckerMuscularDystrophy，BMD)是一种严重性更低的肌营养不良症形式。虽然BMD也是由肌营养不良蛋白基因内的突变引起的，但BMD突变维持了肌营养不良蛋白的读码框。BMD肌营养不良蛋白含有内部缺失，但还保留N末端部分和C末端部分二者。因此，BMD肌营养不良蛋白比野生型蛋白短，但仍可充当肌动蛋白微丝和细胞外基质之间的接头。事实上，根据内部缺失的大小，BMD患者可只有轻微的症状。因此，大多数研究工作集中于将严重的DMD表型转化为较不严重的BMD表型。基因组工程是指用于对活生物体的遗传信息(基因组)进行靶向、特异性修饰的策略和技术。基因组工程是一个非常活跃的研究领域，因为它具有广泛的可能应用，特别是在人类健康领域；例如校正携带有害突变的基因，以探索基因的功能。为将基因插入活细胞中而开发的早期技术(例如转基因)通常受限于新序列插入基因组中的随机性。新基因通常被盲目地放置，并且可能会使其他基因的功能失活或受到干扰，或甚至造成严重的不良影响。此外，这些技术一般不提供任何程度的重复性，因为不能保证新序列会被插入两个不同细胞中的相同位置。最近的基因组工程策略(例如ZFNs、TALENs、HEs和MegaTALs)使得能够修饰DNA的特定区域，从而与早期技术相比提高了校正或插入的准确性，并提供了一定程度的重复性。尽管如此，这种最近的基因组工程策略也有局限性。多项研究表明，基因组工程将是治疗DMD的有吸引力的策略。最早的方法之一涉及工程化小于4kb的小型肌营养不良蛋白基因，并且其可被包装到腺相关病毒(AAV)载体中。这是已经在小鼠(Wang,B.,J.Li和X.Xiao,ProcNatlAcadSciUSA,2000.97(25):第13714-9页)(Watchko,J.等人,HumGeneTher,2002.13(12):第1451-60页)和狗模型(Wang,Z.等人,MolTher,2012.20(8):第1501-7页)中实验检测的置换基因疗法，并且I期临床试验表明：存在与对非自体合成表位的免疫应答相关的问题(Mendell,J.R.等人,NEnglJMed,2010.363(15):第1429-37页)。最近，使用寡核苷酸介导的外显子跳读来重建DMD患者细胞中的读码框。在这种策略中，短的寡核苷酸阻断在前mRNA中发现的剪接信号并促使单个外显子的跳读。单个外显子的跳读允许转录机制绕过提前的终止密码子并产生具有完整N末端和C末端的蛋白质。I/II期临床试验显示：每周注射反义寡核苷酸诱导外显子跳读和肌营养不良蛋白阳性纤维(Cirak,S.等人,Lancet,2011.378(9791):第595-605页)。然而，这类治疗的主要限制是：其需要在患者的一生中重复给药，因为药物靶向前mRNA而不是基因组位点。正在进行的II/III期临床试验正在评估通过AAV递送外显子跳读寡核苷酸以实现持续表达，以及递送多种反义寡核苷酸以促使多外显子跳读策略。尽管来自全世界的研究人员和医学专业人员一直努力尝试解决DMD，并且尽管基因组工程方法具有前景，但仍然迫切需要开发安全有效的对DMD的治疗，DMD是最普遍的致衰弱性遗传障碍之一。概述本公开给出了解决DMD遗传基础的方法。通过利用基因组工程工具使基因组产生永久性变化，利用少至一次的治疗，就能够重建(restore)肌营养不良蛋白的读码框并重建肌营养不良蛋白活性，所产生的疗法能够校正引起该疾病的根本基因缺陷。本文提供了细胞、离体和体内方法，所述方法用于通过基因组编辑来缺失、插入或置换(缺失和插入)肌营养不良蛋白基因中的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点，从而使基因组产生永久性变化，并重建肌营养不良蛋白的读码框和重建肌营养不良蛋白的蛋白活性，其能够用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。本文还提供了用于进行所述方法的组分、试剂盒和组合物。此外，本文提供了通过所述方法产生的细胞。本文提供了通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括以下步骤：向所述人类细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点的永久性缺失、插入或置换，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。所述人类细胞可以是肌肉细胞或肌肉前体细胞。本文还提供了用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的离体方法，所述方法包括以下步骤：i)产生DMD患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；ii)在所述iPSC的肌营养不良蛋白基因内或附近编辑；iii)使基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞；和iv)将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。产生患者特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括以下步骤：向所述人类细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点的永久性缺失、插入或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.28 US 62/247,484;2016.04.18 US 62/324,0641.一种通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括以下步骤：向所述人类细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点的永久性缺失、插入或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。2.权利要求1所述的方法，其中所述人类细胞是肌肉细胞或肌肉前体细胞。3.一种用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的离体方法，所述方法包括以下步骤：i)产生DMD患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；ii)在所述iPSC的肌营养不良蛋白基因内或附近编辑；iii)使基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞；和iv)将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。4.权利要求3所述的方法，其中所述产生步骤包括：a)从所述患者分离体细胞；和b)向所述体细胞内引入多能性相关基因的集合以诱导所述体细胞变成多能干细胞。5.权利要求4所述的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。6.权利要求4所述的方法，其中所述多能性相关基因的集合是一个或更多个选自OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG和cMYC的基因。7.权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述编辑步骤包括：向所述iPSC中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点的永久性缺失、插入或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。8.权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述分化步骤包括以下一项或更多项以使所述基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞：使所述基因组编辑的iPSC与特定培养基制剂接触，所述特定培养基制剂包括小分子药物；转基因过表达；或血清饥饿。9.权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述植入步骤包括：通过局部注射到期望的肌肉中将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。10.一种用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的体内方法，所述方法包括编辑所述患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因的步骤。11.权利要求10所述的方法，其中所述编辑步骤包括：向所述患者的细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点的永久性缺失、插入或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。12.权利要求11所述的方法，其中所述细胞是肌肉细胞或肌肉前体细胞。13.权利要求1、7或11中任一项的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在分子的重组体，其密码子优化版本，或其经修饰版本，以及它们的组合。14.权利要求13所述的方法，其中所述方法包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种多核苷酸。15.权利要求13所述的方法，其中所述方法包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种核糖核酸(RNA)。16.权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种多核苷酸或一种或更多种RNA是一种或更多种经修饰的多核苷酸或一种或更多种经修饰的RNA。17.权利要求13所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种蛋白质或多肽。18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)。19.权利要求18所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。20.权利要求18或19所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。21.权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板。23.权利要求22所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。24.权利要求22所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。25.权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述供体模板是单链多核苷酸或双链多核苷酸。26.权利要求1、7或11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个SSB或DSB断裂在5’基因座且第二个SSB或DSB断裂在3’基因座，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供体位点的永久性缺失或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。27.权利要求26所述的方法，其中一种gRNA产生成对的SSB或DSB。28.权利要求26所述的方法，其中一种gRNA包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。29.权利要求26所述的方法，其中所述方法包括第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，并且所述第二gRNA包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。30.权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。31.权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。32.权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。33.权利要求26-32中任一项所述的方法，其中在5’基因座和3’基因座之间存在染色体DNA的缺失。34.权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述缺失是单外显子缺失。35.权利要求34的方法，其中所述单外显子缺失是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53的缺失。36.权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的5’边界。37.权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的3’边界。38.权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的3’边界。39.权利要求36-38中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。40.权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述缺失是多外显子缺失。41.权利要求40所述的方法，其中所述多外显子缺失是外显子45-53或外显子45-55的缺失。42.权利要求40-41中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界。43.权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。44.权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界且3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。45.权利要求42-44中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。46.权利要求26-32中任一项所述的方法，其中在5’基因座与3’基因座之间存在染色体DNA的置换。47.权利要求26-32或46中任一项所述的方法，其中所述置换是单外显子置换。48.权利要求26-32或46-47中任一项所述的方法，其中所述单外显子置换是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的置换。49.权利要求47-48中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿米·梅达·卡巴迪，乍得·艾伯特·考恩，安特·斯文·伦德贝里，
申请(专利权)人：克里斯珀医疗股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH