本发明专利技术涉及一种可特异性识别CRISPR/Cas9基因编辑体系中Cas9蛋白的单克隆抗体的制备方法，目的是提供一种将该抗体用于CRISPR/Cas9基因编辑体系中的外源Cas9蛋白的检测方法。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，在CRISPR/Cas9基因编辑体系中与靶位点序列结合，并对靶位点的DNA进行剪切。制备该抗体的抗原为一段优选的、由大肠杆菌表达、具有免疫原性活性的重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得，该抗体可用于CRISPR/Cas9基因编辑体系的功能性确认，检测经CRISPR/Cas9体系的遗传改良物种(Genetic modified Organisms)。
Preparation and application of a monoclonal antibody against Cas9 protein
The present invention relates to a preparation method of monoclonal antibody which can specifically recognize Cas9 protein in CRISPR/Cas9 gene editing system. The aim is to provide a method for detecting exogenous Cas9 protein in CRISPR/Cas9 gene editing system. Cas9 protein is a nucleic acid endonuclease that binds to the target sequence in the CRISPR / Cas9 gene editing system and splits the DNA of the target site. The prepared antibody is a recombinant protein with immunogenic activity and expressed in E. coli. The final antibody belongs to IgG1 subtype. The sequence encoding its variable region is obtained by gene cloning. The antibody can be used for functional verification of CRISPR/Cas9 gene editing system and detected by CRISPR/Cas9. The genetically modified species of the system (Genetic modified Organisms).
【技术实现步骤摘要】
一种抗Cas9蛋白的单克隆抗体的制备及应用
本专利技术涉及一种可以识别细菌Cas9蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本专利技术提供了一种基因编辑系统中蛋白的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫印迹(WesternBlot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)、流式细胞术(FACS)方式检测使用CRISPR/Cas9系统基因编辑的植物(水稻、玉米、小麦、拟南芥、烟草)，动物，人，细胞，微生物，属于生物检测领域。
技术介绍
Cas9蛋白在CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortrepeats/CRISPR-associated9)系统中具有核酸内切酶功能，全长约1400个氨基酸。CRISPR/Cas系统是基因编辑领域最受欢迎的方法，成为新的研究热点，根据Cas蛋白组分，可以将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等3种不同类型。由RNA介导的CRISPR/Cas9系统属于Ⅱ型，与ZFN(zincfingernuclease)和TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)相比，具有可操作性强，可控性好，构建系统成本低且简单、同时能对多个位点进行基因编辑的优势。经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于植物领域，动物领域以及微生物领域。CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年(IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,AmemuraM,NakataA.Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninchiacoli,andidentificationofthegeneproduct.JBacteriol,1987,169(12):5429–5433)，由于CRISPR/Cas9系统简便、易于操作，已经广泛应用于各领域。在植物领域，农作物水稻和小麦利用CRISPR/Cas9系统进行基因修饰(ShanQW,WangYP,LiJ,ZhangY,ChenKL,LiangZ,ZhangK,LiuJX,XiJJ,QiuJL,GaoCX.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPR-Cassystem.NatBiotechnol,2013,31(8):686–688)；使用CRISPR/Cas9系统在转基因玉米植株中可以瞬时表达和稳定遗传(XingHL,DongL,WangZP,ZhangHY,HanCY,LiuB,WangXC,ChenQJ.ACRISPR/Cas9toolkitformultiplexgenomeeditinginplants.BMCPlantBiology,2014,14:327)。申请号为“CN201380023255”的专利技术专利“通过Cas9-crRNA复合物的RNA指导的DNA裂解”公开了利用编码Cas9的序列和靶向RNA序列的组合物进行遗传转化和基因修饰的完整过程。CRISPR/Cas9成功应用到拟南芥和烟草中(Li，J.F.etal.Multiplexandhomologousrecombination-mediatedgenomeeditinginArabidopsisandNicotianabenthamianausingguideRNAandCas9.NatBiotechnol2013,31(8):688-691)。在动物领域，CRISPR/Cas9系统应用于食蟹猴(NiuY,ShenB,CuiY,etal.GenerationofGene-ModifiedCynomolgusMonkeyviaCRISPR/Cas9-MediatedGeneTargetinginOne-CellEmbryos,Cell,2014,156(4):836-43)，预示着CRISPR/Cas9系统向临床的进展。有报道利用CRISPR/Cas9系统干扰疾病基因，治疗PRKAG2心脏综合征(ChangXie,Ya-PingZhang,LuSong,etal.GenomeeditingwithCRISPR/Cas9inpostnatalmicecorrectsPRKAG2cardiacsyndrome.CellResearch(2016)26:1099–1111)。在微生物领域，利用该技术对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的基因组进行编辑(JEDiCarlo,JENorville,PMali,XRios,JAach,GMChurch.GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems.NucleicAcidsRes,2013,41(7):4336–4343.)。CRISPR/Cas9系统是由核酸和蛋白质构成的核糖蛋白复合物，通过碱基的互补配对完成对靶点的识别。是在转基因技术之后在遗传工程方面又一革命性技术，也将给生命科学的其他研究领域带来巨变，将应用得越来越广泛。采用CRISPR/Cas9技术可以对靶基因进行特异编辑，理论上它不会给健康或环境带来风险，但对于基因编辑产生的品种是否应该受到转基因相关法律的约束还未有定论(HuangS,WeigelD,BeachyRN,LiJ.Aproposedregulatoryframeworkforgenome-editedcrops.NatureGenetics,2016,48(2):109-111)。目前利用基因编辑技术来编辑基因还需要转基因的技术，尽管在后期的株系分离中可以消除转基因痕迹(XuRF,LiH,QinRY,LiJ,QiuCH,YangYC,MaH,LiL,WeiPC,YangJB.Generationofinheritableand“transgeneclean”targetedgenome-modifiedriceinlatergenerationsusingtheCRISPR/Cas9system.ScientificReports,2015,5:11491)。依据检测转基因产品及成分最常用的方法有两类：一类是针对其外源核酸成分的检测技术；另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法。基于DNA的检测方法只能在核酸水平上反映转基因样品是否含有外源DNA，不能检测其外源基因是处于沉默还是表达，因此，其检测结果与转基因外源蛋白的实际含量并无直接关联。加之，DNA在加工过程中会因降解掉而难以检测，而核酸检测方法必须经过专门的核酸提取和纯化过程，增加了额外的工作量。基于外源蛋白的免疫学分析方法，如酶联免疫分析法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体，而在该蛋白的抗体制备方面可资应用的技术和产品几无报道。对该系统的研究多集中于转化效率、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，其特征在于可由小鼠杂交瘤细胞系31534‑12D2和31534‑9B9分泌。
【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于可由小鼠杂交瘤细胞系31534-12D2和31534-9B9分泌。2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQIDNo.1的氨基酸序列经由大肠杆菌重组表达而获得的重组Cas9蛋白片段。3.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其重链和轻链可变区的基因编码序列为SEQID2、SEQID3、SEQID6、SEQID7所示的DNA序列所编码。4.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQID4、SEQID5、SEQID8、SEQID9所示的氨基酸序列。5.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其为小鼠IgG1和IgG2b亚型单克隆抗体。6.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：马晓飞，郭亚璐，武鹏程，陈浩，耿广荟，康昊翔，尹长城，刘国振，吴琳，刘斯奇，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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