一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用技术

技术编号:18844820 阅读:55 留言:0更新日期:2018-09-05 09:06
本发明专利技术涉及脂肪干细胞膜片,特别是一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用。属于组织工程与再生医学领域。该方法包括如下步骤:步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片;步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞;步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。本发明专利技术利用细胞膜片培养基添加外源性因素(TGF‑β1,EGF,PDGF‑BB,17‑β雌二醇)复合子宫内膜细胞共培养,诱导人脂肪干细胞成膜,这个膜片培养体系,诱导成的膜片各上皮标记mRNA表达量上调,免疫荧光显示蛋白CK18表达阳性,提示部分干细胞向上皮细胞转化。这个体系诱导出的膜片在修复子宫内膜上皮方面更有效。

A method of constructing adipose derived stem cell membrane and its application

The invention relates to an adipose stem cell membrane, in particular to a method for constructing an adipose stem cell membrane and its application. It belongs to the field of tissue engineering and regenerative medicine. The method comprises the following steps: step 1) adipose-derived stem cells are selected as seed cells to construct cell membrane; step 2) endometrial cells are used to induce co-cultured cells; step 3) adipose-derived stem cell membrane is constructed by chemical induction and co-culture. In the present invention, human adipose-derived stem cells are induced to form membranes by co-culture of endometrial cells with exogenous factors (TGF_beta 1, EGF, PDGF_BB, 17_beta estradiol) added to the cell membrane culture medium. The expression of mRNA in the epithelial markers of the induced adipose-derived membranes is up-regulated and the expression of CK18 protein is positive by immunofluorescence. Some stem cells were transformed into epithelial cells. The membrane derived from this system is more effective in the repair of endometrial epithelium.

【技术实现步骤摘要】
一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用
本专利技术涉及脂肪干细胞膜片,特别是一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用。属于组织工程与再生医学领域。
技术介绍
正常的子宫内膜分为基底层和功能层,功能层在雌孕激素的作用下发生周期性脱落,脱落后由基底层再生,如果基底层损伤,则子宫内膜功能层无法再生,胶原大量沉积,出现不可逆性瘢痕修复,造成宫腔粘连。90%的宫腔粘连的发生与妊娠或者非妊娠时子宫遭受机械性损伤有关,其中与妊娠相关的清宫术是导致宫腔粘连的主因,世界卫生组织(WHO)统计,全球每年有4000万妇女进行人工流产,中国每年人工流产达1400万人次,排世界第一位宫腔粘连已经成为继发性不孕患者的最常见原因,占继发性不孕症发病原因的8%,它还可导致习惯性流产,试管婴儿植入失败等并发症,严重威胁我国育龄期妇女的生殖健康。目前临床上治疗宫腔粘连的主要方法为宫腔镜下粘连松解术,术后放置宫内节育器等。但各种预防措施的效果均不尽如人意,治疗后粘连再形成的发生率在所有患者中约为3.1%~23.5%,重度患者中可达20%~62.5%。如果子宫内膜损伤面积过大或完全裸露,即使手术恢复了宫腔形态,内膜也很难再生,恢复功能。为了解决这一难题,生殖专家把目标转移到了目前的研究热点组织工程技术上,自从1993年细胞膜片技术专利技术以来,从最初昂贵的温度敏感培养基,发展到现在仅在完全培养基中加入活性因子即可诱导细胞重叠生长,从而获得由细胞、细胞外基质构成,为克服上述缺点带来希望。但是如何能有效防止子宫损伤后形成的宫腔粘连,能使细胞膜片具有促进组织再生机制,从而促进子宫内膜伤口愈合的功效目前还没有定论需要进一步研究。
技术实现思路
为了解决上述问题,本专利技术的目的一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用,本专利技术这种方法是一种新的培养体系用于诱导人的脂肪干细胞形成脂肪干细胞膜片,这种方式诱导形成的膜片不仅含有大量的细胞外基质,同时诱导部分干细胞转化为上皮细胞,更利于修复人子宫内膜上皮组织。本专利技术的技术方案是:一种构建脂肪干细胞膜片的方法,其特征是:该方法包括如下步骤:步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片;步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞;步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。所述步骤1)脂肪干细胞:取脂肪组织20ml,用PBS清洗,眼科剪剪碎后加20ml的0.25%的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min;加入等量的含10%胎牛血清的ɑ-mem完全培养基终止消化,1000转5min离心,去上清,加10ml含10%胎牛血清的ɑ-mem完全培养基重悬接种在75cm2培养瓶中,48h后换液,脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80%-90%时胰酶消化传代。所述步骤2)子宫内膜细胞:取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗,眼科剪剪去血污组织后,剪碎,加入20ml的0.25%Ι型胶原酶,37℃恒温摇床消化120min,加入等体积的含10%胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化,用100目的筛网过滤,将滤液再次使用200目的筛网过滤,收集滤液1000r/min离心10min,弃上清,放入α-MEM完全培养液重悬,1000r/min,再次离心10min,弃上清,α-MEM完全培养液重悬,接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,24h后换液,洗去悬浮细胞碎片和杂质,得子宫内膜细胞。所述步骤3)具体步骤为:将步骤1)的脂肪干细胞按照1*104/cm2密度接种在六孔板中,步骤1)的培养基更换为诱导培养液;孔板中放置transwell小室,小室滤膜孔径为0.8um,小室内按3×103个接种步骤2)子宫内膜细胞,每两天更换诱导培养基,连续培养两周,膜片形成。所述子宫内膜细胞包括子宫内膜基质细胞和子宫内膜上皮细胞。所述化学诱导的诱导培养基为诱导培养基为:由膜片培养基和上皮细胞诱导剂组成,其中,膜片培养基为gibco的ɑ-mem培养基添加10%的FBS和100um/ml维生素C;上皮细胞诱导剂为1ⅹ10-7mol/Lβ-雌二醇、10ng/mlTGF-β1、10ng/mlEGF和10ng/mlPDGF-BB。该方法构建的脂肪干细胞膜片在制备子宫内膜上皮组织修复材料中的应用。本专利技术的优点:本专利技术利用细胞膜片培养基添加外源性因素(TGF-β1,EGF,PDGF-BB,17-β雌二醇)复合子宫内膜细胞共培养,诱导人脂肪干细胞成膜,这个膜片培养体系,诱导成的膜片各上皮标记mRNA表达量上调,免疫荧光显示蛋白CK18表达阳性,提示部分干细胞向上皮细胞转化。这个体系诱导出的膜片在修复子宫内膜上皮方面更有效。下面通过具体实施例对本专利技术做进一步详细说明,但不作为对本专利技术的限定。附图说明图1是本专利技术采用免疫荧光化学方法鉴定子宫内膜细胞鉴定图;图2是本专利技术脂肪干细胞膜片形态学观察图;图2的A为镜下观察膜片中的细胞呈长梭形重叠生长,图2的B为成熟的细胞膜片;图3是本专利技术构建脂肪干细胞膜片组织学形态图,其中,图3中的a为扫描电镜放大300倍观察细胞轮廓,图3中的b为扫描电镜放大5000倍观察细胞轮廓;图4为免疫荧光化学方法鉴定不同处理后的ADSCs第1组和第2组的对照图;图5为免疫荧光化学方法鉴定不同处理后的ADSCs第3组和第4组的对照图;图6为ADSCs上皮细胞标记mRNA表达情况。具体实施方式实施例1一种构建脂肪干细胞膜片的方法,包括如下步骤:步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片;步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞;步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。实施例2一种构建脂肪干细胞膜片的方法,包括如下步骤:步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片;所述脂肪干细胞:取脂肪组织20ml,用PBS清洗,眼科剪剪碎后加20ml的0.25%的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min;加入等量的含10%胎牛血清的ɑ-mem完全培养基终止消化,1000转5min离心,去上清,加10ml含10%胎牛血清的ɑ-mem完全培养基重悬接种在75cm2培养瓶中,48h后换液,脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80%-90%时胰酶消化传代。将脂肪干细胞简写为ADSCs。步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞;所述子宫内膜细胞:取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗,眼科剪剪去血污组织后,剪碎,加入20ml的0.25%Ι型胶原酶,37℃恒温摇床消化120min,加入等体积的含10%胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化,用100目的筛网过滤,将滤液再次使用200目的筛网过滤,收集滤液1000r/min离心10min,弃上清,放入α-MEM完全培养液重悬,1000r/min,再次离心10min,弃上清,α-MEM完全培养液重悬,接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,24h后换液,洗去悬浮细胞碎片和杂质,得子宫内膜细胞。见图1,采用免疫荧光化学方法鉴定子宫内膜细胞显示:角蛋白CK18和波形蛋白Vimentin标记阳性,ERα标记表达阳性,PR标记表达弱阳性。证明上述分离培养的细胞为子宫内膜细胞。步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片;所述步骤3)具体步骤为:将步骤1)的脂肪干细胞按照1*104/cm2密度接种在六孔板中,步骤1)的培本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种构建脂肪干细胞膜片的方法,其特征是:该方法包括如下步骤:步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片;步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞;步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。

【技术特征摘要】
1.一种构建脂肪干细胞膜片的方法,其特征是:该方法包括如下步骤:步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片;步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞;步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。2.根据权利要求1所述的一种构建脂肪干细胞膜片的方法,其特征是:所述步骤1)脂肪干细胞:取脂肪组织20ml,用PBS清洗,眼科剪剪碎后加20ml的0.25%的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min;加入等量的含10%胎牛血清的ɑ-mem完全培养基终止消化,1000转5min离心,去上清,加10ml含10%胎牛血清的ɑ-mem完全培养基重悬接种在75cm2培养瓶中,48h后换液,脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80%-90%时胰酶消化传代。3.根据权利要求1所述的一种构建脂肪干细胞膜片的方法,其特征是:所述步骤2)子宫内膜细胞:取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗,眼科剪剪去血污组织后,剪碎,加入20ml的0.25%Ι型胶原酶,37℃恒温摇床消化120min,加入等体积的含10%胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化,用100目的筛网过滤,将滤液再次使用200目的筛网过滤,收集滤液1000r/min离心10min,弃上清,放入α-MEM完全培养液重悬,1000r/min,再次离心1...

【专利技术属性】
技术研发人员:王晓红肖西峰芦洁李博陈书强孙惠君杨芳王珺张琬琳王晶晶
申请(专利权)人:中国人民解放军第四军医大学
类型:发明
国别省市:陕西,61

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