γ-鹅膏菌素的衍生物制造技术

本发明专利技术涉及γ‑三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ‑三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)和γ‑三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)、γ‑鹅膏菌素的新型衍生物(4)，及其合成方法和新型结构单元。

Derivatives of gamma Amanita

The present invention relates to a novel derivative (4) of gamma trihydroxy amatidine poisonous peptide amide (1; x = 0, 1 or 2), gamma trihydroxy amatidine poisonous peptide amic acid (2; x = 0, 1 or 2) and gamma trihydroxy amatidine poisonous peptide amide isohydroxamic acid (3; x = 0, 1 or 2), gamma amatidine, and its synthesis method and novel structural unit.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】γ-鹅膏菌素的衍生物
本专利技术涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(γ-amaninamide)(1；x＝0、1或2)，γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(γ-amaninamidicacid)(2；x＝0、1或2)，和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(γ-amaninamidichydroxamicacid)(3；x＝0、1或2)，γ-鹅膏菌素(γ-amanitin)的新型衍生物(4)，及其合成方法和新型结构单元。
技术介绍
鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，发现于鬼笔鹅膏(Amanitaphalloides)蕈类中(见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA-依赖性RNA聚合酶II，并且由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白生物合成。细胞内转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管不是共价连接，但是鹅膏菌素与RNA聚合酶II之间的络合是非常紧密的(KD＝3nM)。将鹅膏菌素从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因而使得受影响的细胞不可能恢复。当转录抑制持续太久时，细胞将经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。已经在1981年通过使用与色氨酸(Trp)(氨基酸4，见图1)吲哚环连接的连接体经由重氮化将抗Thy1.2抗体与α-鹅膏菌素偶联而开发了鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗的用途(Davis&Preston,Science213(1981)1385-1388)。Davis&Preston确定了连接的位置为7’位。Morris&Venton同样证明了7’位取代产生了衍生物，其保持了细胞毒活性(Morris&Venton,Int.J.PeptideProteinRes.21(1983)419-430)。专利申请EP1859811A1(2007年11月28日公开)描述了轭合物，其中β-鹅膏菌素的鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子直接(即无连接体结构)与白蛋白或者单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1偶联。此外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T淋巴瘤细胞(Jurkat)的增殖具有抑制作用。虽然建议使用连接体，包括包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件的连接体，但是实际上并没有给出这样的结构，且没有提供更多的细节，例如在鹅膏毒素上的连接位点。专利申请WO2010/115629和WO2010/115630(都于2010年10月14日公开)描述了轭合物，其中抗体，例如抗EpCAM抗体，如人源化抗体huHEA125，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子、(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6’C-原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸3的δC-原子与鹅膏毒素偶联，每种情况下直接偶联或通过抗体与鹅膏毒素之间的连接体偶联。所建议的连接体包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等的元件。另外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌(Capan-1细胞系)、结肠癌(Colo205细胞系)和胆管癌(OZ细胞系)的增殖具有抑制作用。可以从收集的鬼笔鹅膏蕈类子实体或从纯培养物中(ZhangP,ChenZ,HuJ,WeiB,ZhangZ,andHuW,ProductionandcharacterizationofAmanitintoxinsfromapurecultureofAmanitaexitialis,FEMSMicrobiolLett.2005Nov15；252(2):223-8.Epub2005Sep15)分离出鹅膏毒素(amatoxin)。然而，可以获得的鹅膏毒素的量相当低(从天然子实体中，约0.3-3mg/g干物质，从纯培养物中，约10％)并且进一步修饰天然存在的鹅膏毒素变体的灵活性受到了限制(参见[003]和[005]中讨论的参考文献和本文引用的参考文献)。或者，可以使用担子菌(MuraokaS和ShinozawaT.,Effectiveproductionofamanitinsbytwo-stepcultivationofthebasidiomycete,GalerinafasciculataGF-060,JBiosciBioeng.2000；89(1):73-6；报道的产量约为5mg/l培养物)或A.fissa(GuoXW,WangGL,andGongJH,CultureconditionsandanalysisofamanitinsonAmanitaspissa,WeiShengWuXueBao.2006Jun；46(3):373-8；报道的产量为约30μg/l培养物)由发酵获得鹅膏毒素。同样，产量低，并且进一步修饰天然存在的鹅膏毒素变体的灵活性也受到了限制。最后，通过部分或全部合成制备了鹅膏毒素(例如ZanottiG,C,和WielandT.,Synthesisofanaloguesofamaninamide,anamatoxinfromthewhiteAmanitavirosamushroom,IntJPeptProteinRes.1987Oct；30(4):450-9；ZanottiG,WielandT,BenedettiE,DiBlasioB,PavoneV和PedoneC.,Structure-toxicityrelationshipsintheamatoxinseries.SynthesisofS-deoxy[gamma(R)-hydroxy-Ile3]-amaninamide,itscrystalandmolecularstructureandinhibitoryefficiency,IntJPeptProteinRes.1989Sep；34(3):222-8；ZanottiG,PetersenG和WielandT.,Structure-toxicityrelationshipsintheamatoxinseries.Structuralvariationsofsidechain3andinhibitionofRNApolymeraseII,IntJPeptProteinRes.1992Dec；40(6):551-8；Zhao等人，SynthesisofaCytotoxicAmanitinforBiorthogonalConjugation,ChemBioChem16(2015)1420–1425)。值得注意的是，Zanotti等人，1989(上述引文)报道了生物学上无活性的S-脱氧-γ(R)-羟基-异亮氨酸-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成，而活性对映体的合成显然没有成功。此外，Zhao等人(上述引文)报道了从4(S)-4-羟基异亮氨酸开始合成γ-三羟鹅膏毒肽酰胺衍生物。然而，作者发现，所得到的γ-三羟鹅膏毒肽酰胺衍生物的毒性可忽略不计，因此不再进一步开发这种基于γ-三羟鹅膏毒肽酰胺的结构。虽然使用全合成途径来合成鹅膏毒素可以为治疗用途所需的更大量的鹅膏毒素供应提供了选择，并且可以通过使用适当的原料作为结构单元而提供各种新型α-或β-鹅膏毒素变体的构建，然而过去所追求的方法受到以下事实的限制：基本的结构单元，γ,δ-二羟基异亮氨酸或其合成子不能作为纯的非对映异构体获得。尽管WO2014/009025描述了γ,δ-二羟基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化合物，其具有结构(2S,3R,4S)‑CH3‑CH(OR1)‑CH(CH3)‑CH(NHR2)‑C(＝O)OR3(结构6)，其中R1至R3是保护基团，其中R1和R3在可以切割R2的条件下稳定，并且R1和R2在可以切割R3的条件下稳定，特别地，其中R1是烷酰基，特别是乙酰基或CH3COCH2CO‑，R2是Fmoc，并且R3是苄基或叔丁基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.27 EP 15003389.21.一种化合物，其具有结构(2S,3R,4S)-CH3-CH(OR1)-CH(CH3)-CH(NHR2)-C(＝O)OR3(结构6)，其中R1至R3是保护基团，其中R1和R3在可以切割R2的条件下稳定，并且R1和R2在可以切割R3的条件下稳定，特别地，其中R1是烷酰基，特别是乙酰基或CH3COCH2CO-，R2是Fmoc，并且R3是苄基或叔丁基。2.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构6*3.一种用于合成结构6(2S,3R,4S)-CH3-CH(OR1)-CH(CH3)-CH(NHR2)-C(＝O)OR3的化合物的方法，其包括以下步骤：(a)使结构5的化合物与铜或硼络合，特别是与9-硼双环[3,3,1]壬烷(9-BBN)络合；(b)用化合物R1’-C(＝O)-X酰化4-羟基，其中X是离去基团，特别地，其中R1'是烷基，特别是C1-6烷基，特别是甲基；(c)切割金属络合物；(d)用R2基团，特别是Fmoc基团，保护α-氨基；以及(e)用R3基团，特别是苄基或叔丁基，保护羧基。4.一种试剂盒，其包含根据权利要求1或2所述的化合物和用于合成鹅膏毒素或其前体的至少一种另外的试剂。5.一种用于合成鹅膏毒素或其前体分子的方法，其包括以下步骤：(a1)将保护基团R2从根据权利要求1所述的的化合物上切割下来，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏珊娜·沃纳西蒙，维尔纳·西蒙，克里斯蒂安·卢茨，克里斯托夫·米勒，
申请(专利权)人：海德堡医药研究有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE