具有低NPR-C结合的控制释放CNP激动剂制造技术

本发明专利技术涉及具有低NPR‑C亲和性的控制释放CNP激动剂；涉及包含所述控制释放CNP激动剂的药物组合物；它们的用途；和治疗方法。

Controlled release CNP agonists with low NPR-C binding

The present invention relates to a controlled release CNP agonist with low NPR_C affinity; to a pharmaceutical composition comprising said controlled release CNP agonists; their use; and a treatment method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有低NPR-C结合的控制释放CNP激动剂本专利技术涉及具有低NPR-C亲和性的控制释放CNP激动剂；涉及包含所述控制释放CNP激动剂的药物组合物；它们的用途；和治疗方法。软骨发育不全(ACH)是由FGFR3中的功能获得性突变引起的。CNP与其受体利尿钠肽受体B(NPR-B)的结合抑制FGFR3下游信号传导，并由此触发软骨内生长和骨骼过度生长，如在过表达CNP的小鼠和人中所观察到的那样。CNP在软骨中的过度产生或通过静脉内(iv)输注连续递送CNP使得软骨发育不全的小鼠的侏儒症正常化，这提示在超生理(supraphysiological)水平下施用CNP是治疗ACH的策略。然而，由于CNP的半衰期短(静脉内施用后2min)，所以CNP作为治疗剂在儿科人群中具有挑战性，因为它需要连续输注。此外，由于CNP在皮下组织中广泛失活，所以需要静脉内输注。Potter(FEBSJournal278(2011)1808–1817)描述了CNP通过两种降解途径发生清除：受体介导的降解和胞外蛋白酶引起的降解。CNP通过中性内肽酶24.11(NEP)的作用被降解，通过利尿钠肽清除受体NPR-C从体循环中被除去，所述NPR-C结合CNP并使其沉积入溶酶体中，在溶酶体中CNP被降解。NPR-C受体结合所有三种利尿钠肽ANP、BNP和CNP。NPR-C是二硫化物连接的同型二聚体，其与NPR-B和NPR-A的胞外结构域同源，但仅含有37个胞内氨基酸。大多数生理学数据表明，NPR-C的主要作用是通过受体介导的内化和降解过程从胞外环境中清除利尿钠肽(FEBSJournal278(2011)1808–1817)。值得注意的是，从心血管系统清除肽信号传导分子的另外的受体的演变对于利尿钠肽系统是较独特的，因为大多数其它肽信号传导分子如血管紧张素II、内皮素和加压素主要通过胞外蛋白酶降解，并且绝大多数胰岛素被其同源酪氨酸激酶信号传导受体、而不是另外的非酪氨酸激酶受体所内化(FEBSJournal278(2011)1808–1817)。与NPR-C受体的结合的减少代表了开发控制释放CNP激动剂的独特挑战，受体介导的内化和降解过程的减少将用于延长CNP的半衰期。对有效水平的利尿钠肽CNP的增加的暴露具有挑战性。由于利尿钠肽是一族可能影响血容量和血压的激素，所以剂量的增加可能与心血管不良作用相关。在健康志愿者中的研究表明，CNP注射导致收缩压和舒张压均短暂性、但显著地下降，同时心率显著增加(Igaki等人HypertensRes1998；21:7-13)。类似地，在软骨发育不全的治疗的开发中具有增加的NEP抗性的CNP变体(BMN-111)已经在健康志愿者的1期研究中表现出轻度低血压(BioMarin新闻稿，2012年9月26日)。在动物和人中的BMN-111研究已经证明，随着剂量增加，动脉血压(BP)下降，心率(HR)增加。CNP在小鼠、非人灵长类动物、大鼠、狗和人中产生血液动力学作用。为了评估各种CNP变体的心血管作用，给麻醉的野生型FVB/nJ雄性小鼠配备与遥测发射器连接的压力监测导管。所有变体均显示出了类似的BP-降低和HR-增加活性。在大部分动物中，在皮下施用5分钟内观察到了作用，MAP的最大下降出现在剂量后5-20分钟之间。该时机与CNP变体的最大浓度有良好相关性，并且证明了这种生理响应的清晰的PK/PD关系。因为在所测试的剂量与变体之间血液动力学响应类似，所以测定心血管活性不是区分性质(Wendt等人JPharmacolExpTher353:132–149,2015年4月)。除了研究CNP的各种变体之外，通过将CNP原子团(moiety)与PEG或蛋白质化合物缀合获得了不同的CNP缀合物。这些PEG化的和嵌合的CNP表现出了与非PEG化的CNP变体所观察到的类似的血液动力学响应(Wendt,JPharmacolExpTher353:132–149,2015年4月)。由于这些化合物均产生具有显著残留活性的CNP化合物，所以这些化合物均通过NPR-C受体经历受体介导的内化和降解过程，这限制了可实现的半衰期延长。总之，需要更有效、更安全的CNP治疗。因此，本专利技术的目的在于至少部分克服上述缺点。该目的通过控制释放CNP激动剂得以实现，在生理条件下CNP激动剂以至少6小时的释放半衰期从所述的控制释放CNP激动剂中被释放，并且所述的控制释放CNP激动剂具有用IC50定义的比相应的游离CNP激动剂高至少5倍的NPR-C受体亲和性。令人惊讶地发现，CNP对NPR-C的亲和性的这类可逆失活使得所述的控制释放CNP激动剂具有延长的半衰期，从而提供相应的游离CNP激动剂的持续释放。此外，还令人惊讶地发现，CNP的持续释放比每日一次快速推注更有效，因此从控制释放CNP激动剂中连续释放甚至进一步增加了功效。在本专利技术内，使用的术语具有如下含义。本文所用的术语“CNP激动剂”是指活化利尿钠肽受体B(NPR-B)且对NPR-B具有比CNP-22(SEQIDNO:1)的NPR-B活性至多高50倍的EC50的任何化合物。本文所用的对NPR-B的“EC50”是指引起半数最大cGMP产生的控制释放CNP激动剂和CNP激动剂浓度。控制释放CNP激动剂、释放的CNP激动剂和CNP-22的其EC50形式的NPR-B活性是如下测量的：培养在其细胞表面上表达NPR-B的NIH-3T3(鼠胚胎成纤维细胞系)细胞，将所述细胞分别与控制释放CNP激动剂、相应的释放的CNP激动剂或CNP-22一起孵育，用标准cGMP测定法测定细胞内第二信使cGMP的产生。具体地，该测定法如下进行：(1)将表达内源性NPR-B的鼠NIH-3T3细胞在含有5％FBS和5mM谷氨酰胺的DMEMF-12培养基中在37℃和5％CO2下培养；(2)对于每次测定，将50,000个细胞重新混悬于具有IBMX的DulbeccoPBS中，与控制释放CNP激动剂、相应的释放的CNP激动剂或CNP-22一起孵育；各自在不同的浓度下进行；(3)在37℃和5％CO2下孵育30min后，裂解细胞并测定cGMP水平；和(4)由所测定的cGMP水平生成EC50值。优选地，步骤(2)中的IBMX浓度优选为0.5mM。步骤(3)可以使用任何测定cGMP的测定法来进行，这是本领域技术人员公知的标准方法。优选地，步骤(3)用cGMPTR-FRET测定法进行，更优选地用来自Cisbio,Cat.No.62GM2PEB的cGMPTR-FRET测定法进行。由于在这类实验过程中控制释放CNP激动剂释放一定量的CNP激动剂，该释放的CNP激动剂会扭曲结果，所以控制释放CNP激动剂的NPR-B活性的测量优选以不释放CNP激动剂的稳定类似物的形式进行。本文所用的对NPR-C的“IC50”是使用配体结合竞争测定法测定的，在所述测定法中要测定其在NPR-C结合方面的IC50的化合物被允许与组织培养物中细胞表达的NPR-C结合，该结合通过使用所述化合物的荧光标记形式和测量与细胞相关的荧光来竞争。对NPR-C的IC50是要测定其在NPR-C结合方面的IC50的化合物的标记形式产生半数最大荧光信号的浓度。具体地，该测定法如下进行：(1)从细胞烧瓶底部胰蛋白酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.控制释放CNP激动剂，在生理条件下CNP激动剂以至少6小时的释放半衰期从所述的控制释放CNP激动剂中被释放，并且所述的控制释放CNP激动剂具有用IC50定义的比相应的游离CNP激动剂高至少5倍的NPR‑C受体亲和性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.08 EP 16150633.2;2016.07.13 EP 16179292.4;1.控制释放CNP激动剂，在生理条件下CNP激动剂以至少6小时的释放半衰期从所述的控制释放CNP激动剂中被释放，并且所述的控制释放CNP激动剂具有用IC50定义的比相应的游离CNP激动剂高至少5倍的NPR-C受体亲和性。2.权利要求1的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂优选包含选自小分子、天然产物、寡核苷酸、多肽和蛋白质的CNP激动剂。3.权利要求1或2的控制释放CNP激动剂，其中所述的CNP激动剂是多肽。4.权利要求1-3中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的CNP激动剂是CNP。5.权利要求1-4中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂是水不溶性的。6.权利要求1-5中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂选自晶体、纳米粒、微粒、纳米球和微球。7.权利要求1-6中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控释激动剂是包含至少一种CNP激动剂的囊泡，并且其中所述的囊泡是胶束、脂质体或聚合物囊泡。8.权利要求1-7中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂是水溶性的。9.权利要求1-4或8中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂是式(Ia)或(Ib)的CNP激动剂前药其中-D是CNP激动剂原子团；-L1-是可逆前药连接基原子团；-L2-是单化学键或间隔基原子团；-Z是水溶性载体原子团；x是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16的整数；且y是选自1、2、3、4和5的整数。10.药物组合物，其包含权利要求1-9中任意一项的控制释放CNP激动剂和至少一种赋形剂。11.权利要求1-9中任意一项的控制释放CNP激动剂或权利要求10的药物组合物，其用作药剂。12.权利要求11的控制释放CNP激动剂或药物组合物，其中所述药剂用于治疗软骨发育不全。13.权利要求1-9中任意一项的控制释放CNP激动剂或权利要求10的药物组合物，其用在治疗能用CNP治疗的疾病的方法中。14.权利要求13的控制释放CNP激动剂或药物组合物，其中所述的能用CNP治疗的疾病选自：软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小症、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育异常、纯合型软骨发育不全、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋多指(趾)综合征、肢根型点状软骨发育异常、Jansen型骨骺端发育不全、先天性脊椎骺发育不良、骨发育不全症、畸...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·拉乌，U·赫泽尔，K·斯普罗格，F·佛汀各，T·韦格，F·克利曼，
申请(专利权)人：阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK