在造血干细胞中基因编辑的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及生成修饰的造血干细胞或祖细胞的组合物和方法。本发明专利技术的一方面包括修饰的造血干细胞或祖细胞，其包括能够降低内源基因或其部分的表达的核酸，其中内源基因编码包括由嵌合抗原受体(CAR)靶向的抗原结构域的多肽。本发明专利技术的另一方面包括用于生成修饰的造血干细胞或祖细胞的方法。还包括方法和药物组合物，其包括用于过继性疗法和治疗病症比如自身免疫性疾病或癌症的修饰的细胞。

Methods and compositions for gene editing in hematopoietic stem cells

The present invention relates to compositions and methods for generating modified hematopoietic stem cells or progenitor cells. One aspect of the present invention includes modified hematopoietic stem cells or progenitor cells comprising nucleic acids capable of reducing the expression of endogenous genes or parts thereof, wherein endogenous gene encoding includes polypeptides targeting the antigen domain of the chimeric antigen receptor (CAR). Another aspect of the invention includes methods for generating modified hematopoietic stem cells or progenitor cells. Methods and pharmaceutical compositions are also included, including cells modified for adoptive therapy and treatment of diseases such as autoimmune diseases or cancer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在造血干细胞中基因编辑的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请以35U.S.C.§119(e)要求2015年11月4日提交的美国临时专利申请号62/250,561的优先权，其通过引用以其全部并入本文。
技术介绍
强力的抗原特异性免疫疗法比如嵌合抗原受体(CAR)T细胞(CART细胞)、抗体-药物缀合物或双特异性T细胞衔接抗体(BITE)代表癌症治疗的新型途径。增加的效力与增加的中靶脱靶肿瘤(on-targetoff-tumor)毒性相关联，比如由B细胞恶性肿瘤的CART19治疗造成的延长的B细胞发育不全。实质上，这是因为这些模态均不能够区分携带相同细胞表面抗原的恶性细胞和它们的正常对应物。CART细胞是新型疗法，其中T细胞被遗传改造以识别和杀伤在其表面上表达特异性抗原的细胞。CAR是与T细胞表面受体的细胞内信号传导结构域组合的抗体的抗原-识别结构域的杂合物。靶向CD19的CART细胞已经在数次I期临床试验中显示针对B-细胞恶性肿瘤的功效(Grupp等NewEnglandJournalofMedicine.2013；368:1509-1518；Brentjens等Blood.2011；118:4817-4828；和Kochenderfer等Blood.2010；116:4099-4102)并且耗尽正常的B细胞。由于人良好地耐受持久的B-淋巴细胞减少(lymphophenia)，此特定的毒性在CART19后还不是剂量限制性的。然而，靶向急性髓性白血病(AML)抗原比如CD123或CD33的CART细胞根除白血病细胞并且因此耗尽正常的髓样原始粒子(progenitor)，这是由于这些荷载相同的表面抗原，因而导致骨髓发育不全。在AML细胞而非在正常髓样细胞上选择性表达的表面抗原的缺少限制在AML和其它骨髓疾病(其包括骨髓发育不良和骨髓增生性瘤)中使用CART细胞。因此，对选择性地靶向肿瘤细胞而并不耗尽正常的髓样原始粒子存在需要。本专利技术满足此需要。
技术实现思路
本专利技术涉及生成修饰的造血干细胞或祖细胞的组合物和方法。在一方面，本专利技术包括在需要其的对象中保护造血干细胞或祖细胞免受嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的方法。本专利技术的方法包括给对象施用修饰的造血干细胞或祖细胞，其中干细胞或祖细胞包括能够降低内源基因或其部分的表达的核酸，其中内源基因编码包括由CAR靶向的抗原结构域的多肽。在一个实施方式中，本专利技术的方法进一步包括给需要其的对象施用CART细胞疗法。在另一个实施方式中，修饰的细胞进一步包括修饰的内源基因，其编码缺少由CAR靶向的抗原结构域的修饰的多肽。在另一方面，本专利技术包括用于生成修饰的造血干细胞或祖细胞的方法。本专利技术的方法包括将能够降低内源基因或其部分的表达的核酸引入细胞，其中内源基因编码包括由嵌合抗原受体(CAR)靶向的抗原结构域的多肽。在一个实施方式中，方法包括由需要CART细胞疗法的对象获得细胞。在另一个实施方式中，方法进一步包括将修饰的内源基因引入修饰的细胞，其中修饰的内源基因编码缺少由CAR靶向的抗原结构域的修饰的多肽。在一个实施方式中，能够降低内源基因表达的核酸是CRISPR系统。在一个实施方式中，CRISPR系统包括Cas表达载体和特异于内源基因的引导核酸序列。在另一个实施方式中，CRISPR系统包括与特异于内源基因的引导核酸序列复合的Cas9蛋白。在另一个实施方式中，CRISPR系统包括诱导型启动子。在进一步的实施方式中，如本文描述的专利技术的方法进一步包括使造血干细胞或祖细胞暴露于激活Cas表达载体中的诱导型启动子的试剂。在一个实施方式中，内源基因编码肿瘤抗原。在另一个实施方式中，在由CAR靶向的肿瘤细胞上表达内源基因。在又另一个实施方式中，内源基因编码CD33或CD123。在一个实施方式中，修饰的多肽包括与由内源基因编码的多肽的功能等价的至少一种功能。在一个实施方式中，由选自外周血单核细胞、脐带血细胞、骨髓、淋巴结、和脾的来源获得细胞。在一个实施方式中，细胞是CD34+。在一个实施方式中，如本文描述的专利技术的方法包括扩展细胞。在另一个实施方式中，在引入核酸的步骤之前实施扩展。在另一个实施方式中，如本文描述的专利技术的方法包括冷藏细胞。在又另一个实施方式中，如本文描述的专利技术的方法进一步包括在引入核酸之前解冻冷藏的细胞。在一个实施方式中，通过选自转导细胞、转染细胞、和电穿孔细胞的过程实施引入核酸。在另一个实施方式中，修饰的细胞在对象中分化为至少一种血细胞类型。在又另一个实施方式中，修饰的细胞在施用入对象后能够自我更新。在一方面，本专利技术包括组合物，其包括根据本文上面描述的方法生成的修饰的细胞。在另一方面，本专利技术包括药物组合物，其包括根据本文上面描述的方法生成的修饰的细胞和药学上可接受的运载体。在另一方面，本专利技术包括用于过继性细胞转移疗法的方法。方法包括给需要其的对象施用有效量的药物组合物，药物组合物包括根据本文描述的方法生成的修饰的细胞，其中对象被施用有效量的本文描述的细胞以及靶向由内源基因编码的多肽的抗原结构域的CAR疗法，从而治疗对象。在又另一方面，本专利技术包括治疗需要其的对象中的病症的方法。方法包括给对象施用治疗有效量的药物组合物和施用CART细胞疗法，药物组合物包括根据本文描述的方法生成的修饰的细胞，其中CAR包括特异性地靶向由内源基因编码的多肽的抗原结构域的抗原结合结构域，从而治疗病症。在一个实施方式中，病症是自身免疫性疾病。在另一个实施方式中，自身免疫性疾病选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病、和其任意组合。在另一个实施方式中，病症是癌症。在又另一个实施方式中，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、和其任意组合。附图说明当连同附图阅读时，将更好地理解本专利技术的优选实施方式的下列详细描述。出于说明本专利技术的目的，在附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在需要其的对象中保护造血干细胞或祖细胞免受嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的方法，所述方法包括给所述对象施用修饰的造血干细胞或祖细胞，其中所述干细胞或祖细胞包括能够降低内源基因或其部分的表达的核酸，其中所述内源基因编码包括由CAR靶向的抗原结构域的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.04 US 62/250,5611.在需要其的对象中保护造血干细胞或祖细胞免受嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的方法，所述方法包括给所述对象施用修饰的造血干细胞或祖细胞，其中所述干细胞或祖细胞包括能够降低内源基因或其部分的表达的核酸，其中所述内源基因编码包括由CAR靶向的抗原结构域的多肽。2.权利要求1所述的方法，进一步包括给所述需要其的对象施用所述CART细胞疗法。3.权利要求1所述的方法，其中所述能够降低内源基因表达的核酸是CRISPR系统。4.权利要求3所述的方法，其中所述CRISPR系统包括Cas表达载体和特异于所述内源基因的引导核酸序列。5.权利要求3所述的方法，其中所述CRISPR系统包括与特异于所述内源基因的引导核酸序列复合的Cas9蛋白。6.权利要求3所述的方法，其中所述CRISPR系统包括诱导型启动子。7.权利要求6所述的方法，进一步包括使所述造血干细胞或祖细胞暴露于激活所述Cas表达载体中的所述诱导型启动子的试剂。8.权利要求1所述的方法，其中所述内源基因编码肿瘤抗原。9.权利要求1所述的方法，其中在由所述CAR靶向的肿瘤细胞上表达所述内源基因。10.权利要求1所述的方法，其中所述内源基因编码CD33或CD123。11.权利要求1所述的方法，其中所述修饰的细胞进一步包括修饰的内源基因，其编码缺少由所述CAR靶向的所述抗原结构域的修饰的多肽。12.权利要求11所述的方法，其中所述修饰的多肽包括与由所述内源基因编码的多肽的功能等价的至少一种功能。13.用于生成修饰的造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括将能够降低内源基因或其部分的表达的核酸引入所述细胞，其中所述内源基因编码包括由嵌合抗原受体(CAR)靶向的抗原结构域的多肽。14.权利要求13所述的方法，进一步包括由需要CART细胞疗法的对象获得所述细胞。15.权利要求13所述的方法，其中由选自外周血单核细胞、脐带血细胞、骨髓、淋巴结、和脾的来源获得所述细胞。16.权利要求13所述的方法，其中所述细胞是CD34+。17.权利要求13所述的方法，其中所述能够降低内源基因表达的核酸是CRISPR系统。18.权利要求17所述的方法，其中所述CRISPR系统包括与特异于所述内源基因的引导核酸序列复合的Cas9蛋白。19.权利要求17所述的方法，其中所述CRISPR系统包括Cas表达载体和特异于所述内源基因的引导核酸序列。20.权利要求17所述的方法，其中所述CRISPR系统包括诱导型启动子。21.权利要求20所述的方法，进一步包括使所述造血干细胞或祖细胞暴露于激活所述Cas表达载体中的所述诱导型启动子的试剂。22.权利要求13所述的方法，其中所述内源基因编码肿瘤抗原。23.权利要求13所述的方法，其中在由所述CAR靶向的肿瘤细胞上表达所述内源基因。24.权利要求13所述的方法，其中所述内源基因选自CD33和CD123。25.权利要求13所述的方法，进一步包括将修饰的内源基因引入所述修饰的细胞，其中所述修饰的内源基因编码缺少由所述CAR靶向的所述抗原结构域的修饰的多肽。26.权利要求25所述的方法，其中所述修饰的多肽包括包括与由所述内源基因编码的多肽的功能等价的至少一种功能。27.权利要求13所述的方法，进一步包括扩展所述细胞。28.权利要求27所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·吉尔，M·吉姆，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US