一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，采用直接竞争法反应原理，将多种喹诺酮类药物的单克隆抗体以微阵列形式固定于微孔板底部，制备成微孔板生物芯片阵列，并依次与喹诺酮类纳米材料标记的混合人工抗原、喹诺酮类药物标准品反应，最后用银增强显色，并采用可视化芯片扫描仪对微孔板显色结果进行快速扫描成像，图像采用芯片分析软件处理。本发明专利技术方法极大地减短了检测时间，提高了灵敏度，实验操作简单；对于喹诺酮类9种抗生素可同时分别检测，提高了检测效率，对喹诺酮类多项药物残留分析方法研究具有重要意义，具有很好的应用推广价值，为食品中氟喹诺酮类的残留检测提供一定的参考。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法
本专利技术属于药物残留检测技术，特别是涉及一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法。
技术介绍
喹诺酮类药物(Fluoroquinolones,FQs)是一类具有6-氟-7-哌嗪-4-诺酮环结构(母核结构)的抗菌药物。喹诺酮类药物是近年发展起来的一类广谱抗菌药，也是近几年来世界各国竞相开发与应用的新品种，到目前为止已经有多种药物在市场上投放。为了控制和治疗动物疾病，养殖和治疗动物过程中会有多种喹诺酮类药物同时或交替使用的情况，这就导致了药物多残留的发生。动物性食品中的喹诺酮类药物残留超标对人体存在潜在的威胁，这类兽药残留问题越来越被人们关注。人们长期食用喹诺酮类药物残留超标的食物可能引起人体的肠胃不适，易造成腹痛，腹泻以及呕吐；还有可能引起中枢系统的不良反应如抽搐、头晕甚至可能会引起癫痫。美国食品药品管理局强调喹诺酮类抗生素会对神经造成永久性的损伤。喹诺酮类药物可能影响儿童的软骨发育并引起皮肤光毒性反应如荨麻疹、红斑及皮肤潮红伴随瘙痒，甚至存在致畸、致癌、致突变的作用。喹诺酮类药物全身性损害主要表现为过敏性反应和过敏性休克，其他包括发热、寒战、多汗、乏力、水肿等。其中，过敏性休克主要为速发型变态反应，多数经治疗或抢救后治愈，也有少数患者死亡。喹诺酮类药物对泌尿系统损害主要表现为肾功能损害，包括尿频、少尿、结晶尿、尿液混浊、蛋白尿等。目前，多个国家和机构规定了喹诺酮类药物的使用标准以及其最高残留限量。日本规定了喹诺酮类药物最大允许残留量为10～100μg/kg，而我国规定中不同品种喹诺酮类药物的最大残留量在30～500μg/kg之间。鸡、牛、羊、兔、猪等动物的脂肪、肌肉、肝、肾食品中诺氟沙星、培氟沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量10～1900μg/kg。氟喹诺酮类药物的国内外残留研究方法主要有微生物检测法、色谱法、免疫分析法。其中色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用分析法(LC/MC)、高效液相色谱-荧光法(HP)LC/FL、高效薄层色谱法(HPTLC)等，免疫分析检测法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金试纸条法、蛋白芯片法等。微生物法的优点是操作简便、成本低、检测快速，但该法的检测限量高于各国所规定的最低检测限量；灵敏度不高，特异性差。色谱法虽然检测结果精确，但是存在技术操作复杂、检测时间长、前处理繁锁、设备昂贵、及费用高等缺点，所以其不适于大规模的现场快速检测。免疫法中酶联免疫吸附(ELISA)测定及胶体金试纸条技术作为一种方便、低成本、快速、高通量的筛选手段，广泛应用于众多领域，但是ELISA只能检测单组分残留，而胶体金试纸条技术容易出现高的假阳性率或假阴性率。蛋白芯片法具有特异性强，反应十分灵敏，对于大量样品的快速检测，具有检测多组分残留、特异性高、操作简单、高通量、检测时间很短、成本低等优点，在国内外的研究中被广泛应用于食品监测、临床监测、病毒监测等领域，我们有理由相信，随着科技的迅猛发展，免疫分析将最有可能取代色谱仪器分析成为此类药物最常用的方法。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种利用可视化蛋白芯片分析技术对待测样品中多种喹诺酮类抗生素多残留含量的同时检测方法。技术方案：本专利技术所述的一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，包括以下步骤：(1)制备可视化蛋白芯片：将喹诺酮类单克隆抗体在芯片载体上进行点样操作，恒温孵育固定，加入封闭剂继续恒温孵育，然后洗涤拍干；(2)特异性结合反应：取步骤(1)制备所得可视化蛋白芯片，向孔板内加入喹诺酮类不同浓度梯度的混合标准品或待检测样品，每个标准品或样品重复至少两个孔；再加入纳米银标记的喹诺酮类混合抗原，贴上盖膜板后恒温振荡孵育，孵育完成后洗涤拍干；(3)显色反应：向步骤(2)反应后的孔板内加入纳米银增强显色液，恒温振荡孵育，然后用超纯水洗涤拍干；(4)处理分析：利用可视化生物芯片扫描仪对步骤(3)处理后的蛋白芯片进行扫描，并利用芯片分析软件进行结果处理分析。步骤(1)中，所述恒温孵育均是指保持4-37℃孵育0.5-16h；步骤(2)和步骤(3)中，所述恒温振荡孵育是指在4-37℃孵育5-60min。本专利技术方法中，所述喹诺酮类抗生素选自氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、萘啶酸和氟甲喹中的一种或多种。步骤(1)中，所述芯片载体采用微孔板、玻片、膜或高分子片基，制备喹诺酮类单克隆抗体矩阵，每样喹诺酮类单克隆抗体重复1-10个点，点样量为50nL/点；步骤(1)中，所述封闭剂是指牛血清白蛋白(BSA)。步骤(1)中，所述氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、氟甲喹、恩诺沙星的固定抗体浓度为1:1-1:100稀释，点样量为10-100nL/点。步骤(2)中，所述每个孔内加入的混合标准品或待检测样品的量为10-100μL，浓度范围为0.1-40ng/mL。步骤(2)中，所述每个孔内加入的纳米银标记的喹诺酮类混合抗原的量为10-100μL，浓度范围为1:2-1:128稀释。步骤(2)中，所述纳米银标记的喹诺酮类混合抗原为氧氟沙星、洛美沙星、萘啶酸、氟甲喹分别为1:4-1:128稀释。步骤(3)中，所述银增强显色液为显色液A和显色液B体积比1:1混合，现配现用。其中，显色液A、显色液B可从祥中科技直接购买,产品名称可视化显色液。所述银增强显色液用量为10-100μL/孔。步骤(1)和步骤(2)中，所述洗涤是指采用洗涤液洗涤2-4次，每次10-15s；步骤(3)中，所述洗涤是指采用超纯水洗涤2-4次，每次10-15s。步骤(2)中，所述待检测样品可以是牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品等等。综合来讲，本专利技术采用直接竞争法反应原理，将多种喹诺酮类药物的单克隆抗体以微阵列形式固定于微孔板底部，制备成微孔板生物芯片阵列，并依次与喹诺酮类纳米材料标记的混合人工抗原、喹诺酮类药物标准品反应，最后用银增强显色，并采用可视化芯片扫描仪对微孔板显色结果进行快速扫描成像，图像采用芯片分析软件处理。有益效果：相比较于现有技术，本专利技术方法采用固定抗体、标记抗原的方法，极大地减短了检测时间，提高了灵敏度，实验操作简单；对于喹诺酮类9种抗生素可同时分别检测，提高了检测效率，对喹诺酮类多项药物残留分析方法研究具有重要意义，具有很好的应用推广价值，为食品中氟喹诺酮类的残留检测提供一定的参考。通过本专利技术方法检测9种喹诺酮类药物的加标回收率分别在70％～130％之间，且相对标准偏差均在15％以内，能够用于9种喹诺酮类药物的残留的同时快速初筛。附图说明图1是本申请检测原理示意图；图2是样品点样顺序示意图；图3是不同浓度标准品检测结果扫描图；图4是喹诺酮类药物标准曲线；图5是牛奶中喹诺酮类药物加标检测结果扫描图。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。实施例所需试剂和设备来源：喹诺酮类单克隆抗体(氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、萘啶酸、氟甲喹)、纳米银标记的喹诺酮类人工抗原(氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、萘啶酸、氟甲喹)、喹诺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备可视化蛋白芯片：将喹诺酮类单克隆抗体在芯片载体上进行点样操作，恒温孵育固定，加入封闭剂继续恒温孵育，然后洗涤拍干；(2)特异性结合反应：取步骤(1)制备所得可视化蛋白芯片，向孔板内加入喹诺酮类不同浓度梯度的混合标准品或待检测样品，每个标准品或样品重复至少两个孔；再加入纳米银标记的喹诺酮类混合抗原，贴上盖膜板后恒温振荡孵育，孵育完成后洗涤拍干；(3)显色反应：向步骤(2)反应后的孔板内加入纳米银增强显色液，恒温振荡孵育，然后用超纯水洗涤拍干；(4)处理分析：利用可视化生物芯片扫描仪对步骤(3)处理后的蛋白芯片进行扫描，并利用芯片分析软件进行结果处理分析。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备可视化蛋白芯片：将喹诺酮类单克隆抗体在芯片载体上进行点样操作，恒温孵育固定，加入封闭剂继续恒温孵育，然后洗涤拍干；(2)特异性结合反应：取步骤(1)制备所得可视化蛋白芯片，向孔板内加入喹诺酮类不同浓度梯度的混合标准品或待检测样品，每个标准品或样品重复至少两个孔；再加入纳米银标记的喹诺酮类混合抗原，贴上盖膜板后恒温振荡孵育，孵育完成后洗涤拍干；(3)显色反应：向步骤(2)反应后的孔板内加入纳米银增强显色液，恒温振荡孵育，然后用超纯水洗涤拍干；(4)处理分析：利用可视化生物芯片扫描仪对步骤(3)处理后的蛋白芯片进行扫描，并利用芯片分析软件进行结果处理分析。2.根据权利要求1所述的同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述喹诺酮类抗生素选自氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、萘啶酸和氟甲喹中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述芯片载体采用微孔板、玻片、膜或者高分子片基，制备喹诺酮类单克隆抗体矩阵，每样喹诺酮类单克隆抗体重复1-10个点。4.根据权利要求1所述的同时检测喹诺酮类抗生素残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、氟甲喹、恩诺沙星的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李周敏，许丹科，李钟卉，姜金斗，
申请(专利权)人：南京祥中生物科技有限公司，黑龙江省农垦乳品检测中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32