sCD40L蛋白在制备早期诊断主动脉夹层试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于诊断试剂盒分子生物学领域，具体涉及sCD40L蛋白在制备早期诊断主动脉夹层试剂盒中的应用。该诊断试剂是以sCD40L蛋白作为标记物对其在血浆中的表达量进行检测，早期诊断主动脉夹层出现的风险，可迅速、有效的诊断主动脉夹层，且具有创伤小，简单易行的特点。

【技术实现步骤摘要】
sCD40L蛋白在制备早期诊断主动脉夹层试剂盒中的应用
本专利技术属于诊断试剂盒分子生物学领域，具体涉及sCD40L蛋白在制备早期诊断主动脉夹层试剂盒中的应用。
技术介绍
主动脉夹层系一种病情凶险、死亡率极高的疾病，主动脉增强CT、核磁共振成像(MRI)等影像学检查为目前诊断主动脉夹层的主要方式，但以上方法存在诊断延迟、价格昂贵、操作复杂等缺点，且均为有创检查，目前诊断主动脉夹层尚缺乏特异性生物标志物。以往研究证实一些有望早期诊断主动脉夹层的生物学标志物，但其敏感性、特异性较差。因此，急需找到一些特异生物学标志物来快速诊断主动脉夹层。CD40L是肿瘤坏死因子(TNF-α)家族的一种跨膜糖蛋白，主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞和肥大细胞表面，提供B淋巴细胞活化所必需的协同刺激信号。另外它还表达于粥样斑块中的单核细胞、巨噬细胞、B细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，可促进基质金属蛋白酶(MMPs)和氧自由基的释放。既往研究认为sCD40L蛋白在动脉硬化的发生发展中起关键作用，而少有研究报道sCD40L蛋白与主动脉夹层的关系。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供sCD40L蛋白在主动脉夹层患者中的诊断价值，主要涉及sCD40L蛋白在主动脉夹层患者组织学及血浆学中的表达；本专利技术提供了sCD40L蛋白在制备早期诊断主动脉夹层试剂盒中的应用。为了实现上述问题，本专利技术提供采用如下技术方案：sCD40L蛋白在制备主动脉夹层早期诊断试剂盒的中的应用，该诊断试剂是以sCD40L蛋白作为标记物对其在血浆中的表达量进行检测，对主动脉夹层进行早期诊断。该诊断试剂盒用包括：洗液、稀释液、标准液、CD40L抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素、TMB发光底物、终止液。该诊断试剂盒主要是检测血浆中sCD40L蛋白的含量。该诊断试剂盒的使用方法包括如下步骤：步骤1、血浆的采集：研究对象入院后即刻抽取其静脉血，用含EDTA真空抗凝管收集血标本5ml。步骤2、样本的处理：抽取静脉血10分钟内，抗凝管3000转/min离心处理10min，分离血浆，将处理好的血浆储藏于-80℃冰箱保存，用本专利技术检测试剂盒检测入选研究对象血浆sCD40L浓度；促凝管采集血标本即刻送本院检验科，检测其hs-CRP、D-二聚体浓度。步骤3、ELISA方法检测血浆中sCD40L表达含量，以实验孔和副孔的平均值作为检测对象的测定值。步骤4、数据的标准化处理：按照试剂盒说明书配制sCD40L标准品浓度，根据说明书要求按浓度梯度依次加入标准品，建立标准曲线。步骤5、血浆标志物的检测：用乳胶免疫比浊法检测入选对象血浆hs-CRP浓度；用NycoCard法检测入选对象血浆D-二聚体浓度。步骤6、主动脉夹层患者血浆中sCD40L的表达水平：结合主动脉造影结果，根据测得的血浆中的sCD40L、hs-CRP、D-二聚体的水平，观察其随时间变化，生物标志物的变化，并根据AUC曲线下面积判断更为准确的生物标志物。步骤7、免疫组织化学检测sCD40L在主动脉夹层行主动脉置换术的患者主动脉组织及正常对照主动脉组织的表达。CD40L为相对分子量33～40kD的Ⅱ型跨膜糖蛋白，由266个氨基酸组成，其编码基因定位于X染色体短臂上，与肿瘤坏死因子(TNF)在氨基酸序列上具有较高同源性，故属于TNF超家族成员。CD40L是一种跨膜糖蛋白，主要表达在CD4+的T淋巴细胞表面，与其受体CD40结合后，介导B细胞的活化、增殖及促进抗体生成，促进体液免疫的产生，分为可溶性和膜结合性两型。可溶性CD40L(sCD40L)具有强的生物活性，可与B淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞上的CD40相互作用，刺激这些细胞产生大量生物活性因子:如E-选择素、粘附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶等，既往研究表明基质金属蛋白酶可以降解包括胶原和弹力蛋白在内的细胞外基质，引起广泛的基质破坏，从而破坏血管壁正常结构重组，因此，sCD40L与主动脉夹层的发生发展存在某种相关关系。申请人通过研究发现，主动脉夹层患者的破裂口处sCD40L大量表达，说明sCD40L与主动脉夹层的形成存在相关关系；在主动脉夹层急性期主动脉破口处及血浆中sCD40L均大量表达。因此，血浆sCD40L可以在早期精确的诊断出主动脉夹层。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：可迅速、有效的诊断主动脉夹层，且具有创伤小，简单易行的特点。附图说明图1为ELISA检测sCD40L在血浆中的表达。1-1为对照组与主动脉夹层组sCD40L在血浆中的表达。1-2为对照组、急性冠脉综合征、主动脉夹层组sCD40L在血浆中的表达。1-3为对照组、主动脉穿透性溃疡、假性动脉瘤、急性主动脉壁内血肿、主动脉瘤、主动脉夹层组sCD40L在血浆中的表达。1-4为对照组、慢性主动脉夹层、亚急性主动脉夹层、急性主动脉夹层sCD40L在血浆中的表达。其中：control：对照组；PAU:主动脉穿透性溃疡；PSA:假性动脉瘤；AIMH:急性主动脉壁内血肿；AA:主动脉瘤。图2为ELISA检测血浆中sCD40L、hs-CRP、D-二聚体在不同时间点的表达。2-1为血浆sCD40L浓度的时相性改变。2-2为血浆hs-CRP浓度的时相性改变。2-3为血浆D-二聚体浓度的时相性改变。2-4血浆sCD40L、hs-CRP、D-二聚体三者浓度的时相性改变。图3为主动脉夹层患者血浆sCD40L、hs-CRP、D-二聚体浓度的ROC曲线图。3-1为主动脉夹层患者血浆sCD40L浓度的ROC曲线图。3-2为主动脉夹层患者血浆hs-CRP浓度的ROC曲线图。3-3为主动脉夹层患者血浆D-二聚体浓度的ROC曲线图。3-4为主动脉夹层患者血浆sCD40L、hs-CRP、D-二聚体浓度三者共同的ROC曲线。图4为sCD40L在对照组、慢性主动脉夹层、亚急性主动脉夹层、急性主动脉夹层患者组织中的表达。其中：A–D：对照组主动脉；E–H：慢性主动脉夹层；I–L：亚急性主动脉夹层；M–P：急性主动脉夹层；HE：A/E/I/M–×25高倍视野；B/F/J/N–×100高倍视野；免疫组化：C/G/K/O–×25高倍视野；D/H/L/P–×100高倍视野。图5为主动脉夹层连续切片行免疫组化染色，对健康人、慢性主动脉夹层、亚急性主动脉夹层、急性主动脉夹层患者组织进行sCD40L、SMA、CD68、MPO、caspase3、MMP9免疫组化染色，观察其表达。其中：HE染色：I-IV×25高倍视野；免疫组化染色：对照组：A/E/I/M/Q/U×100高倍视野；慢性主动脉夹层：B/F/J/N/R/V×100高倍视野；亚急性主动脉夹层：C/G/K/O/S/M×100高倍视野；急性主动脉夹层：sCD40L免疫组化染色：A-D；SMA免疫组化染色:E-H；CD68免疫组化染色:I-L；MPO免疫组化染色：M-P；caspase3免疫组化染色：Q-T；MMP9免疫组化染色：U-X。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1本专利技术的研究基础。1、酶联免疫吸附实验检测主动脉夹层患者血浆sCD40L表达变化。1.1、研究对象。连续入选2015年5月至2017年3月因胸痛就诊于沈阳军区总医院心血管内科，经主动脉增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.sCD40L蛋白在制备主动脉夹层早期诊断试剂盒的中的应用，其特征在于，该诊断试剂盒是以sCD40L蛋白作为标记物对其在血浆中的表达量进行检测，对主动脉夹层进行早期诊断。

【技术特征摘要】
1.sCD40L蛋白在制备主动脉夹层早期诊断试剂盒的中的应用，其特征在于，该诊断试剂盒是以sCD40L蛋白作为标记物对其在血浆中的表达量进行检测，对主动脉夹层进行早期诊断。2.根据权利要求1所述的sCD40L蛋白在制备主动脉夹层早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该诊断试剂盒用包括：洗液、稀释液、标准液、CD40L抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素、TMB发光底物、终止液。3.根据权利要求1所述的sCD40L蛋白在制备主动脉夹层早期诊断试剂盒的中的应用，其特征在于，该诊断试剂盒主要是检测血浆sCD40L蛋白的含量。4.根据权利要求1所述的sCD40L蛋白在制备主动脉夹层早期诊断试剂盒的中的应用，其特征在于，该诊断试剂盒的使用方法包括如下步骤：步骤1、血浆的采集：抽取静脉血，收集血样本；步骤2、样本的处理：抽取静脉血10分钟内，离心处理10min，分离血浆，将处理好的血...

【专利技术属性】
技术研发人员：王效增，何瑞霞，张效林，张权宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军沈阳军区总医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21