一种人抗缪勒氏管激素测定试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种人抗缪勒氏管激素AMH均相检测试剂盒的制备方法，包括：制备包含受体及与之结合的第一结合单元的组分，受体能与单线态氧反应生成可检测信号，第一结合单元能结合AMH的第一表位；制备包含第一标记物及与之结合的第二结合单元第二组分，第二结合单元能结合AMH的第二表位，第二表位与第一表位是AMH的不同结合特性的表位或不同位置的相同结合特性的表位；制备包含供体以及与之结合的所述第一标记物的特异结合物的第三组分，供体能够在激发状态产生单线态氧。经该方法制备的试剂盒能够高效检测AMH。

【技术实现步骤摘要】
一种人抗缪勒氏管激素测定试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术属于生物分子检测
，涉及一种无基质效应的均相免疫检测试剂盒，具体涉及一种抗人缪勒氏管激素均相发光免疫检测试剂盒及其制备和使用方法。
技术介绍
抗缪勒氏管激素(anti-mullerianhormone,AMH)作为缪勒氏管的抑制物质，属于转化生长因子-β家族的二聚体糖蛋白。在性腺器官发育过程中，AMH起着重要作用，是确保男、女性器官发育和性腺功能的重要物质之一。在男性体内，AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿发育过程中，AMH导致缪勒氏管退化并形成男性生殖管道。男性新生儿期的AMH含量较高，出生后数月仍上升，2岁后缓慢下降，青春期下降最明显，至成人降至最低。在女性体内，胚胎早期因不能合成AMH导致缪勒氏管发育成子宫、双侧输卵管等女性器官。发育至36周时，卵巢颗粒细胞产生AMH，出生后由窦前卵泡和小窦颗粒细胞产生。自婴儿起体内AMH水平与年龄呈正向相关，随着年龄增长逐渐上升，青春期(约15.8岁)AMH达到高峰，至25岁前保持稳定。但自25岁后AMH水平和年龄呈负相关，随着年龄增长逐渐下降，直至绝经期降到很低水平而无法检出。目前，血清AMH定量分析方法包括酶联免疫分析法、酶促发光免疫分析和电化学发光免疫分析。酶联免疫分析法采用碱性磷酸酶作为标记物，96微孔板作为固相载体，包被捕获抗体。酶促发光免疫法分析模式与酶联免疫分析法相似，不同点是采用发光底物，通过测定光信号的定量分析。电化学发光采用三联吡啶钌作为标记物，配合使用三丙胺和电极诱导发光。上述三种AMH免疫分析方法，具备共同特点是它们均属于非均相免疫分析(Heterogeneousimmunoassay)。非均相免疫分析是指抗体-抗原反应后、检测信号前，需要分离去除未参加反应的、游离状态的标记抗体或其他组分。分离结合标记物和游离标记物常用的方法是固相吸附分离技术。针对AMH定量分析而言，将捕获抗体与固相载体连接，待检抗原分别与标记抗体和捕获抗体结合，于固相材料表面形成双抗体夹心复合物(结合标记物位于固相表面)，而过量的、未参与抗原抗体反应的游离标记抗体分布于液相中。去除液相溶液、并反复洗涤固相(微粒)。固相吸附分离方法有两个重要环节：包被和洗涤。此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面：1.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被于固相材料表面的抗体分子其构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。2.“洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密度，出现批间、批内差异。固相吸附分离方法由于每次洗涤过程需要消耗时间，也必然由于洗涤分离所带来“误差”。洗涤误差是非均相免疫分析误差的重要来源，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和分析敏感度。出于这种考虑，本专利技术的专利技术人进行了研究，期望提供一种具有较高的精密度、准确度和灵敏度，操作方法简便，且能够定量检测人抗缪勒氏管激素AMH水平的检测试剂盒以及检测方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术基于均相免疫方法，制备定量检测血清抗缪勒氏管激AMH试剂盒，建立双抗体夹心血清抗缪勒氏管激AMH定量分析方法，经优化制备试剂盒，主要表现在：优选一对针对抗缪勒氏管激AMH的抗体分别标记生物素和受体；分析体系经过优化(抗体用量和缓冲液等)，其分析性能满足行业标准和临床与科研实验室要求。此产品的主要特征是采用均相光免疫分析，整个检测过程无分离洗涤过程，不会产生额外废液，免除洗涤误差，具有较高的精密度、准确度和灵敏度。此外，本专利技术的试剂盒以及检测方具有较好的放大效应、且分析精密度较高，从而赋予本专利技术具有非常高的分析灵敏度。本专利技术要解决的问题是提供一种血清抗缪勒氏管激(anti-mullerianhormone)均相发光免疫测定试剂盒及其制备和使用方法，以解决现有非均相免疫试剂盒繁琐洗涤步骤；同时，克服放射免疫分析环境污染，货架期短的缺陷，克服酶免疫分析重复性差，易发生“钩状效应”缺陷。本专利技术采用发光免疫分析，具有较高的敏感度和精密度。较为具体地，本专利技术第一方面提供了一种人抗缪勒氏管激均相检测试剂盒的制备方法，所述方法包括：制备第一组分，所述第一组分包含受体以及与之结合的第一结合单元，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测信号，所述第一结合单元能够结合人抗缪勒氏管激的第一表位；制备第二组分，所述第二组分包含第一标记物以及与之结合的第二结合单元，所述第二结合单元能够结合人抗缪勒氏管激的第二表位，所述第二表位与所述第一表位是人抗缪勒氏管激的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位；制备第三组分，所述第三组分包含供体以及与之结合的所述第一标记物的特异结合物，所述供体能够在激发状态产生单线态氧。在本专利技术的一些实施方案中，所述第一结合单元和所述第二结合单元分别独立选自与所述人抗缪勒氏管激具有结合特异性的单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体、修饰的抗体、两种或更多种单克隆抗体混合物和多克隆抗体，优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体。在本专利技术的一些实施方案中，所述标记物为生物素，所述标记物的所述特异结合物为链霉亲和素。在本专利技术的一些实施方案中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒；和/或，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。在本专利技术的一些实施方案中，所述制备方法还包括：制备第一组合物，所述第一组合物包括所述第一组分和第一缓冲液；制备第二组合物，所述第二组合物包括所述第二组分和第二缓冲液；制备第三组合物，所述第三组合物包括所述第三组分和第三缓冲液；优选地，所述第一缓冲液、所述第二缓冲液与所述第三缓冲液分别独立地选自pH8.0，0.1MTris-HCl溶液。在本专利技术的一些实施方案中，所述第一组合物的制备方法包括：步骤S1，利用碳酸盐缓冲液将所述受体稀释至4～6mg/mL，获得受体溶液；步骤S2，在所述受体溶液中加入第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段，静止后再加入用碳酸盐缓冲液稀释至8～12mg/mL的BSA溶液，获得与所述第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段结合的受体溶液；步骤S3，分离与所述第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段结合的受体溶液中的与所述第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段结合的所述受体，并加入第一缓冲溶液，获得所述第一组合物。在本专利技术的一些实施方案中，所述第二组合物的制备方法包括：步骤T1，将第二抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段置于透析袋内利用标记缓冲液进行透析，透析结束后加入生物素溶液，并补入透析缓冲液，静止，获得与生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人抗缪勒氏管激均相检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：制备第一组分，所述第一组分包含受体以及与之结合的第一结合单元，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测信号，所述第一结合单元能够结合人抗缪勒氏管激的第一表位；制备第二组分，所述第二组分包含第一标记物以及与之结合的第二结合单元，所述第二结合单元能够结合人抗缪勒氏管激的第二表位，所述第二表位与所述第一表位是人抗缪勒氏管激的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位；制备第三组分，所述第三组分包含供体以及与之结合的所述第一标记物的特异结合物，所述供体能够在激发状态产生单线态氧。

【技术特征摘要】
1.一种人抗缪勒氏管激均相检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：制备第一组分，所述第一组分包含受体以及与之结合的第一结合单元，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测信号，所述第一结合单元能够结合人抗缪勒氏管激的第一表位；制备第二组分，所述第二组分包含第一标记物以及与之结合的第二结合单元，所述第二结合单元能够结合人抗缪勒氏管激的第二表位，所述第二表位与所述第一表位是人抗缪勒氏管激的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位；制备第三组分，所述第三组分包含供体以及与之结合的所述第一标记物的特异结合物，所述供体能够在激发状态产生单线态氧。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一结合单元和所述第二结合单元分别独立选自与所述人抗缪勒氏管激具有结合特异性的单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体、修饰的抗体、两种或更多种单克隆抗体混合物和多克隆抗体，优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述标记物为生物素，所述标记物的所述特异结合物为链霉亲和素。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒；和/或，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：制备第一组合物，所述第一组合物包括所述第一组分和第一缓冲液；制备第二组合物，所述第二组合物包括所述第二组分和第二缓冲液；制备第三组合物，所述第三组合物包括所述第三组分和第三缓冲液；优选地，所述第一缓冲液、所述第二缓冲液与所述第三缓冲液分别独立地选自pH8.0，0.1MTris-HCl溶液。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述第一组合物的制备方法包括：步骤S1，利用碳酸盐缓冲液将所述受体稀释至4～6mg/mL，获得受体溶液；步骤S2，在所述受体溶液中加入第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段，静止后再加入用碳酸盐缓冲液稀释至8～12mg/mL的BSA溶液，获得与所述第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段结合的受体溶液；步骤S3，分离与所述第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段结合的受体溶液中的与所述第一抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段结合的所述受体，并加入第一缓冲溶液，获得所述第一组合物。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述第二组合物的制备方法包括：步骤T1，将第二抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段置于透析袋内利用标记缓冲液进行透析，透析结束后加入生物素溶液，并补入透析缓冲液，静止，获得与生物素结合的第二抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段；步骤T2，将与生物素结合的第二抗人抗缪勒氏管激抗体或其结合片段置于透析袋内利用透析缓冲液进行透析，透析结束后加入第二缓冲液，获得所述第二组合物。8.一种用于均相检测人抗缪勒氏管激的试剂盒，其是根据权利要1-7中任一项所述的人抗缪勒氏管激均相检测试剂盒的制备方法制备得到的。9.根据权利要求8所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐静心，史舟芳，强中华，李会强，刘宇卉，李临，
申请(专利权)人：北京科美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11